本流程以磁珠分选阳性选择法为核心，完成人源 CD14+ 单核细胞的分选，并开展后续树突状细胞（DC）的诱导分化，为后续人源树突状细胞功能验证及 T 细胞激活功能检测实验提供实验基础与操作依据。

一、人源树突状细胞诱导及T细胞激活功能检测实验

二、通过阳性选择法分离CD14+单核细胞

1. 在确定外周血单个核细胞（PBMCs）的大致总数后，弃去最后一次离心产生的上清液，将沉淀物按每10^7个细胞80 μl的比例重悬于磁珠缓冲液中。随后通过加入20 μl溶液对细胞进行标记。

2. CD14微珠按供应商规格配置，每10^7个细胞使用一个微珠。将细胞悬液充分混匀后置于4°C培养箱中孵育。15分钟后，加入微珠缓冲液将细胞稀释至终体积10毫升，以250g（1200转/分钟）离心10分钟进行洗涤。随后将沉淀物再次稀释，此时细胞浓度为10^8个/500 μl，即可进行磁珠分离。

3. 与此同时，将LS层析柱置于分离器的磁场环境中，并用3毫升磁珠缓冲液进行冲洗。待柱体储液槽排空后，将细胞悬液上样至柱体并收集流出液。随后使用3毫升磁珠缓冲液对柱体进行三次洗涤，每次洗涤前必须确保储液槽完全排空。此时收集的总流出液仅包含未标记细胞（CD14-），即分离过程中的阴性组分。

4. 为获取标记细胞（阳性组分），将层析柱转移至15 ml离心管中，并加入5 ml磁珠缓冲液进行上样。

5. 随后，将配备色谱柱的柱塞立即投入使用，并收集洗脱组分。该洗脱组分即为目标CD14+细胞组分。分离后的细胞在细胞计数板中进行计数，并通过流式细胞术进行质量控制评估。分离细胞经250g（1200转/分钟）离心10分钟后，重悬于冷冻培养基中，细胞浓度为6.25 × 10^6个/毫升，随后于-80°C条件下冷冻保存以备后续使用。CD4+ T细胞分选同理。

三、树突状细胞诱导分化

1) 单核细胞（CD14+ 细胞）分离完成后，将其重悬于培养基中，浓度为1×10^6个细胞/毫升，并添加750 U/mL白细胞介素（IL）-4和1000 U/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）以促进其向树突状细胞（DC）分化。随后将细胞悬液分装至24孔培养板（每孔1 ml）中。

2) 细胞被转移至培养箱中，并在37°C、含5%CO2的湿润环境中进行培养。每隔两天，轻柔地移除一半培养基，并替换为等量新鲜培养基，同时补充与先前所述相同浓度的IL-4和GM-CSF。经过7天的细胞因子培养后，单核细胞已分化为树突状细胞（DCs），为评估其成熟度及细胞死亡率，这些细胞被移出培养体系。

3) 此时可能需要确定分化效率，该指标将初始待分化的树突状细胞（DCs）数量与单核细胞数量相关联。

试剂及耗材清单