1. 获取细胞或组织，在细胞染色缓冲液中制备单细胞悬液；
（可选）对于实体组织：加入约20mL缓冲液，400×g离心5min，弃上清

2. 裂解红细胞：如需（如外周血），向样品中加入5-10倍体积的1×裂解液，室温孵育3-5min。
⚠️ 注意：使用前将裂解液平衡至室温

3. 加入等体积细胞染色缓冲液终止裂解。3000 rpm离心5min，弃上清；重复步骤一次

4. 计数活细胞，用缓冲液重悬至10⁷ 细胞/mL

6. 用缓冲液将细胞重悬至5-10 × 10⁶ 细胞/mL，向每管分装100μL

7. 加入最适浓度的一抗，冰上避光孵育30min

8. 400×g离心3min，弃上清。加入至少1mL缓冲液重悬洗涤；重复洗涤一次

9. 若使用纯化一抗，加入最适浓度荧光二抗，冰上避光孵育20-30min；重复洗涤两次

10. 按说明书稀释可固定活力染料。每管加100 μL，室温孵育10-20min

11. 400×g离心3min，弃上清，用1mL缓冲液洗涤一次；最后加入200μL 上机分析

12. 每管加100 μL固定/破膜缓冲液，涡旋混匀；4°C避光孵育30min

13. 加100 μL破膜缓冲液，300g离心5min，弃上清

14. 用100 μL破膜缓冲液重悬细胞；加入适量细胞因子胞内抗体，4℃避光孵育30min

15. 用2ml流式染色缓冲液洗涤两次

16. 若仅标记一抗，加入200 μL染色缓冲液后上机；（若需标记二抗或链霉亲和素，重复步骤14-15）