从零到一，小白速成

本文旨在提供一套从样本制备、磁珠分选到结果验证的完整、标准化操作流程，其中包括常见的人或小鼠组织（外周血、脾脏）样本制备流程，并以人外周血分离高纯度目标免疫细胞CD3⁺ T细胞为例进行详细阐述。

一、样本制备-Human外周血样本

Human外周血样本-磁珠分选验证流程

密度梯度离心法操作步骤：

1. 样本预处理：将白细胞层用PBS按3:2（样本:PBS）比例稀释，1100 g（2500 rpm）离心10分钟（无制动）。

2. 收集白细胞：收集离心后形成的中间层（主要含白细胞），用PBS重悬并定容至20 mL。

3. 密度梯度分离：将上述细胞悬液小心加至12 mL Ficoll溶液（密度1.077 g/ml）上层。1100 g（2500 rpm）离心20分钟（无制动）。

4. 收集PBMCs：离心后，收集位于Ficoll层与血浆层之间的云雾状PBMCs层。

5. 洗涤：用PBS将PBMCs重悬并定容至10 mL，按以下顺序洗涤三次：

6. 第一次：250 g（1200 rpm）离心10分钟。

7. 第二、三次：110 g（800 rpm）离心5分钟（后两次可在4°C进行以利于去除血小板）。

8. 计数：末次离心前，取少量样本，用细胞计数板于光学显微镜下进行细胞计数。

二、样本制备-Mouse脾脏样本

小鼠脾脏样本制备：

1. 将脾脏组织转移到70μm细胞过滤器，置于15或50mL无菌锥形管上，并用1ml推荐培养基润洗滤网。注意：细胞可能会黏附于干燥的滤网上，润洗滤网可以减少这种情况。

2. 从5ml无菌注射器中取出活塞/柱塞。使用扁平的末端部分以温和画圆的方式研磨脾脏，碾磨至无明显红色结团为止，这样可以破坏脾脏和髓质，释放脾细胞。

3. 使用润洗过的1mL移液枪将脾细胞吹打均匀。

4. 将收集到离心管里的脾脏细胞平衡后放置于离心机离心，转速为300g，离心时间5min。取出离心管，倒去上清，轻轻敲击试管重悬细胞。

浑浊度变化：裂解前，血液样本通常呈浑浊状，因为红细胞的存在使样本不透明。裂解完成后，样本应变得澄清透明。

三、案例展示：采用磁珠分选技术分离CD3+T细胞

T淋巴细胞（CD3+ 细胞）采用 CD3 微珠（阳性选择法），具体步骤如下：

1) 在确定外周血单个核细胞（PBMCs）的大致总数后，弃去最后一次离心产生的上清液，将沉淀物按每10^7个细胞80 μl的比例重悬于磁珠缓冲液中。随后通过加入20 μl溶液对细胞进行标记。

2) CD3微珠按供应商规格配置，每10^7个细胞使用一个微珠。将细胞悬液充分混匀后置于4°C培养箱中孵育。15分钟后，加入微珠缓冲液将细胞稀释至终体积10毫升，以250g（1200转/分钟）离心10分钟进行洗涤。随后将沉淀物再次稀释，此时细胞浓度为10^8个/500 μl，即可进行磁珠分离。

3) 与此同时，将LS层析柱置于分离器的磁场环境中，并用3毫升磁珠缓冲液进行冲洗。待柱体储液槽排空后，将细胞悬液上样至柱体并收集流出液。随后使用3毫升磁珠缓冲液对柱体进行三次洗涤，每次洗涤前必须确保储液槽完全排空。此时收集的总流出液仅包含未标记细胞（CD3-），即分离过程中的阴性组分。

4) 为获取标记细胞（阳性组分），将层析柱转移至15 ml离心管中，并加入5 ml磁珠缓冲液进行上样。

5) 随后，将配备色谱柱的柱塞立即投入使用，并收集洗脱组分。该洗脱组分即为目标CD3+细胞组分。分离后的细胞在细胞计数板中进行计数，并通过流式细胞术进行质量控制评估。分离细胞经250g（1200转/分钟）离心10分钟后，重悬于冷冻培养基中，细胞浓度为6.25 × 10^6个/毫升，随后于-80°C条件下冷冻保存以备后续使用。

Human CD3磁珠分选验证数据

其他案例数据展示：

试剂及产品清单