经常做抗体的小伙伴都知道抗体是一种 Y 型四链结构，根据其结构有三大功能区，也是蛋白酶水解的特征片段：

1. Fab 段（抗原结合片段）
组成：Y 型的两个 "臂"，由 V_H + C_H1与 V_L+C_L 构成。
功能：特异性结合抗原，一个单体抗体拥有 2 个 Fab 段，可结合 2 个抗原分子。

2. Fc 段（可结晶片段）
组成：Y 型的 "柄部"，由两条重链的 C_H2、 C_H3 结构域组成。
功能：结合免疫细胞 Fc 受体、激活补体系统、决定抗体免疫原性与半衰期；实验中蛋白 A/G 纯化抗体，主要结合 Fc 段。

3. 铰链区
位置：位于 C_H1 和 C_H2 之间，富含脯氨酸，结构松散、柔性极强。
功能：允许两个 Fab 臂自由摆动，适配不同空间位置的抗原表位；该区域易被蛋白酶切割。

Fab片段由一条完整的轻链和重链的Fd段（VH-CH1）组成，分子量约为50 kDa。木瓜蛋白酶在IgG铰链区上方的特定位点切割，产生两个相同的Fab片段和一个Fc片段。每个Fab片段含有单一的抗原结合位点，因此是单价结合分子。Fab片段保留了与完整抗体相当的抗原亲和力，但由于缺乏二价结合效应，其整体亲和力（avidity）通常低于完整抗体。

F(ab')₂片段由两个Fab'片段通过铰链区的二硫键连接而成，分子量约为110 kDa。胃蛋白酶在IgG铰链区下方的特定位点切割，产生一个完整的F(ab')₂片段和多个降解的Fc小肽。F(ab')₂保留了两个抗原结合位点，因此是双价结合分子，具有与完整抗体相似的亲和力优势。此外，F(ab')₂片段经温和还原后可裂解为两个含游离巯基的Fab'片段，后者可直接用于标记偶联反应。

木瓜蛋白酶（Papain）是一种非特异性巯基内肽酶，分子量约为23 kDa，其活性位点含有必需巯基，必须在还原状态下才具有催化活性。当IgG分子在还原剂（如半胱氨酸或DTT）存在下与木瓜蛋白酶共孵育时，酶分子识别并切割IgG铰链区，使重链在铰链区上方断开，从而产生两个Fab片段和一个Fc片段。

木瓜蛋白酶消化通常在近中性pH（pH 6.5-7.5）条件下进行，这一温和的反应环境有助于维持抗体片段的结构完整性和抗原结合活性。消化反应可通过加入碘乙酰胺等烷化剂终止，也可通过快速分离酶与产物来控制。固定化木瓜蛋白酶树脂是近年来的优选方案，它能实现酶与产物的快速分离，避免过度消化，同时防止可溶性巯基蛋白酶与抗体形成不利于片段化的酶-抗体加合物。

将待消化的单克隆抗体样品用消化缓冲液（含20 mM磷酸盐、10 mM EDTA，pH 7.0）稀释至适当浓度（通常2-10 mg/mL）。确保抗体纯度良好，避免杂蛋白干扰消化效率。如需使用固定化木瓜蛋白酶树脂，按说明书预先平衡树脂。

将木瓜蛋白酶粉末用消化缓冲液溶解，配制成5 mg/mL的母液。若使用可溶性木瓜蛋白酶，需现配现用；若使用固定化树脂，按所需柱体积称取树脂并用缓冲液充分洗涤平衡。

在消化缓冲液中加入半胱氨酸至终浓度10-50 mM，用于激活木瓜蛋白酶的巯基活性位点。

将木瓜蛋白酶按1:20至1:100（w/w，酶:抗体）的比例加入抗体溶液中，37°C孵育2-4小时。消化过程中可定时取样进行SDS-PAGE分析，监测消化进度。

加入碘乙酰胺至终浓度20-30 mM，室温孵育15分钟以不可逆地灭活木瓜蛋白酶。若使用固定化树脂，可通过离心或过滤快速去除树脂，实现即时终止。

将消化产物过Protein A/G亲和柱，Fab片段不结合而流穿，Fc片段和未消化抗体被保留在柱上。收集流穿液，即为粗制Fab片段溶液。

Fab片段的鉴定通常采用SDS-PAGE电泳。在非还原条件下，Fab呈现约50 kDa的单一条带；在还原条件下，可观察到约25 kDa的轻链和~25 kDa的Fd片段。

胃蛋白酶（Pepsin）是一种非特异性酸性内肽酶，分子量约为35 kDa，仅在酸性pH（最适pH 1-4）条件下具有活性，在中性或碱性pH下会发生不可逆变性。当IgG分子在酸性条件下与胃蛋白酶共孵育时，酶分子识别并切割IgG铰链区，产生一个完整的F(ab')₂片段和多个降解的Fc小肽。

与木瓜蛋白酶不同，胃蛋白酶在产生F(ab')₂的同时，会将Fc区域彻底降解为小分子肽段，这些小肽可通过后续纯化步骤轻松去除。F(ab')₂片段保留了铰链区的二硫键，因此两个Fab'臂仍共价连接。在特定实验需求下，F(ab')₂可经2-巯基乙胺（2-MEA）温和还原裂解为两个含游离巯基的Fab'片段，后者可直接用于与马来酰亚胺等活性基团的定点偶联标记。

将单克隆抗体溶液用酸性缓冲液（如100 mM醋酸钠，pH 4.0-4.5）透析或稀释，调整pH至4.0-4.5。

胃蛋白酶粉末用预冷的酸性缓冲液溶解，配制成适当浓度（如1-2 mg/mL）。胃蛋白酶对温度敏感，应全程在冰上或4°C操作。固定化胃蛋白酶树脂需预先用酸性缓冲液平衡。

将胃蛋白酶按1:20至1:100（w/w，酶:抗体）的比例加入酸化后的抗体溶液中，37°C孵育4-6小时。消化时间需根据具体抗体优化，可通过定时取样监测。低温消化（4°C）可减少非特异性切割，提高片段均一性。

将反应液pH迅速调至7.5-8.0（使用1 M Tris），胃蛋白酶在碱性条件下不可逆失活。若使用固定化树脂，通过离心或过滤去除树脂即可终止反应。

用适当缓冲液（如PBS，pH 7.4）透析或换液，将样品恢复至中性pH，以便进行后续纯化步骤。

将中和后的消化产物过Protein A亲和柱，收集流穿液。F(ab')₂片段及降解Fc肽均不结合（或弱结合），未消化抗体和Fc被保留。此步骤可去除大部分未消化的完整抗体。降解Fc肽可通过透析去除。

F(ab')₂片段的鉴定采用SDS-PAGE电泳。在非还原条件下，呈现约110 kDa的单一条带；在还原条件下，可观察到~25 kDa轻链和~35 kDa重链Fd'片段。