ipsc人诱导多能干细胞（hiPSC）诱导分化肥大细胞-细胞因子套装

1、人诱导多能干细胞（iPSC）的常规培养

1.1接种与包被：将人诱导多能干细胞（hiPSC）接种于基质胶预包被的六孔培养板中。

1.2培养基与培养条件：使用 mTeSR Plus 完全培养基，置于 37℃、5% CO₂ 恒温培养箱中常规培养，并依据细胞生长状况进行换液与传代。

2、胚状体（EB）的诱导形成

2.1消化与收集：待 iPSC 细胞汇合度达到 70-90% 时，吸弃培养基，加入 1 mL PBS 润洗一次并吸弃。加入 ReLeSR 消化液，室温孵育 30 秒后吸弃消化液。

2.2细胞团块制备：将培养板置于 37℃、5% CO₂ 培养箱中静置 5 分钟，随后加入 1 mL mTeSR™ Plus 培养基终止消化反应。轻轻吹打培养面，使细胞形成大小适宜的片状/团块状聚集体（注意避免吹打成单细胞悬液）。

2.3悬浮培养与诱导：以T25培养瓶为例，按 1:8 的传代比例将细胞团块转移至超低吸附六孔板中，加入 EB 诱导培养基，置于培养箱中悬浮培养 5 天，期间每 2-3 天进行换液。

EB诱导培养基成分：DMEM/F12 基础培养基、20% KnockOut™ 血清替代物（KSR）、1% 非必需氨基酸（NEAA）、1% GlutaMax™、0.1 mM 2-巯基乙醇、1-2 ng/mL bFGF。（注：诱导的前24-48h内需额外添加10 μM Y-27632以提升细胞存活率）。

3、髓系细胞形成复合体（MCFC）的建立与培养

3.1转移与接种：EB培养到第6天，用剪刀剪掉枪头尖，挑取EB，六孔板按每孔 25-30个EB的密度接种至0.1%明胶预包被的培养板中。

3.2 MCFC 诱导培养：加入 Mast Cell Media I（MC 培养基 I）（配方见下方），置于培养箱中继续培养 6-7 天，以促进髓系细胞形成复合体（MCFC）及造血祖细胞的生成。

3.3 MC 培养基 I 成分：APEL 培养基、100 ng/mL IL-6、100 ng/mL SCF、25 ng/mL Flt-3L、5 ng/mL IL-3。

4、悬浮细胞收获与表型分析

4.1释放期观察：接种 1 周后，MCFC 开始逐渐向培养基中释放悬浮细胞，细胞释放量在培养的第2至4周逐渐增多。

4.2 收集与检测：收集悬浮细胞时，轻拍培养板侧壁，收集富含悬浮细胞的上清液。离心后，可使用流式细胞术对收集的细胞进行表面标志物检测（如 CD34、CD45、CD123、c-Kit、FcεRI 等），以评估造血祖细胞的诱导情况。

5、肥大细胞的成熟诱导

5.1换液与诱导：收集 MCFC 释放到培养基中的悬浮细胞，离心重悬后，将细胞转移至 Mast Cell Media II（MC 培养基 II）（配方见下方）中进行成熟诱导。MCFC再重新补充Mast Cell Media I培养基，继续培养，每周收集一次悬浮细胞。

5.2成熟培养：将细胞置于 MC 培养基 II 中培养 2-3 周，持续促进其向成熟肥大细胞分化。最后一周可加倍细胞因子用量，以促进肥大细胞的成熟。

5.3质量鉴定：成熟诱导结束后，收集细胞进行流式细胞术检测，通过鉴定 c-Kit、FcεRI、CD45RA、CD123 等成熟标志物表达情况，确认肥大细胞的身份。

MC 培养基 II 成分：RPMI 1640 培养基（含 GlutaMax™）、10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素、1 mM 丙酮酸钠、1% NEAA、100 ng/mL SCF、100 ng/mL IL-6。