人单核细胞诱导破骨细胞分化细胞因子套装

人单核细胞诱导破骨细胞分化：

1、CD14⁺单核细胞分选

1.1复苏冻存的PBMC，室温300g离心5min。弃去上清，使用完全培养基 α-MEM（含10% FBS和1%双抗）重悬细胞，并进行细胞计数与活率检测（活率应大于95%）；按照分选磁珠说明书加入CD14阳性分选磁珠（CD14 Nanobeads, human，货号S0K0004）对细胞进行标记、分离并收集CD14⁺细胞。取少量分选后的细胞，使用流式细胞术检测CD14⁺ 细胞纯度，为确保后续实验质量，建议纯度应大于95%；

2、破骨细胞诱导分化

2.1用完全培养基 α MEM（含10% FBS和1%双抗）将分选后的CD14⁺ 细胞密度调整至2×10⁵ cells/mL。按每孔1mL接种于24孔板中，并立即加入重组人细胞因子M-CSF（50ng/mL），将24孔板置于37℃、5% CO₂的培养箱中开始培养；

2.2 每2-3天更换一次完全培养基。更换时，轻柔吸弃旧液，并加入等体积的、含有相同浓度的M-CSF。7天后，向培养基中补充 RANKL (100ng/mL) 以启动破骨细胞分化进程。此后持续维持M-CSF与 RANKL双因子协同诱导，期间每2-3天更换新鲜完全培养基，并补充等体积的、含有相同浓度的M-CSF和RANKL。直至第 12-14 天，镜下可见多核巨细胞形成，TRAP 染色阳性且具备骨吸收功能，即视为成功获得成熟破骨细胞。

3、 细胞形态学观察与鉴定

3.1 形态观察：自诱导开始，定期在倒置显微镜下观察细胞形态变化。通常，在RANKL诱导5天 后，可观察到典型的多核破骨细胞样结构；

3.2 TRAP染色验证： M-CSF与 RANKL双因子协同诱导 5-7天 后，进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色以特异性鉴定破骨细胞。严格按照 TRAP染色试剂盒的说明书步骤进行染色操作。染色完成后，在光学显微镜下观察。成熟破骨细胞定义为TRAP染色阳（胞浆呈红色或红紫色）且含有 3 个或 3 个以上细胞核。