小鼠骨髓细胞(BMMs)诱导破骨分化细胞因子套装

1.骨髓细胞接种

1.1 将现取的小鼠骨髓细胞裂红后，用含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM完全培养基重悬，并进行细胞计数。

1.2 将细胞密度稀释至2 × 105 cells/mL，并加入M-CSF至终浓度为30ng/mL，细胞接种于已预先放置无菌盖玻片的24孔细胞培养板中，每孔加入1mL细胞悬液。

1.3 将培养板置于37°C、5% CO₂的细胞培养箱中静置培养5天，每2天换一次液（含30ng/mL M-CSF） 。

2.破骨细胞诱导分化

2.1 吸弃孔内旧培养基。阴性孔中加入含30ng/mL M-CSF的完全培养基，阳性孔中加入含30ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANK L蛋白的完全培养基。

2.2此后，每2天更换一次培养基。阴性孔中加入含30ng/mL M-CSF的完全培养基，阳性孔中加入含30ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANK L蛋白的完全培养基。

3. 细胞形态学观察与鉴定

3.1形态观察：自诱导开始，定期在倒置显微镜下观察细胞形态变化。通常，在RANK L诱导 4天 后，可观察到破骨细胞样结构。

3.2 TRAP染色验证：RANK L诱导 5-7天 后，进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色以特异性鉴定破骨细胞。严格按照TRAP染色试剂盒的说明书步骤进行染色操作。

染色完成后，在光学显微镜下观察。成熟的破骨细胞胞浆呈红色或红紫色。