人MO-DC单核诱导分化树突状细胞因子套装

Human MO-DC Differentiation Cytokine Kit

Datasheet COA

价格￥2,880.00 （ 1-2周）

货号 UA090052

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产品规格

分子别名

Human MO-DC Differentiation Cytokine Kit
性状

Lyophilized Powder

溶解方法

IL-4

GM-CSF

TNF-α

IL-1β

IL-6

Reconstitute at 0.1-1 mg/ml according to the size in ultrapure water after rapid centrifugation.

PGE2

1. 储存液制备：取1 mg PGE2溶于100 μL无水乙醇中，配制成10 mg/mL的储存液，分装成单次小量后，-20℃冻存，6个月以上稳定。

2. 工作液制备：

1）使用前将储存液室温解冻后，用适当缓冲液（0.1 M PBS，pH7.2）或者等渗盐溶液稀释成工作液，注意使用时确保有机溶剂的残留量对实验无影响，因为即使小量有机试剂也可能会对研究对象造成生理学影响。

【注】：PGE2在水溶性酸或者碱溶液中一般都不稳定，其在pH 6-7溶液内稳定性最好。

2）若要配制完全不含有机溶剂的PGE2水溶液，可将其直接溶于PBS，pH 7.2，溶解性约为5 mg/mL。

【注】避免PGE2溶于碱性溶液（pH＞7.4），因为碱可使PGE2降解为PGA和PGB混合物。建议该水溶液避光存放不超过1天，2-8℃保存。PGE2的水溶性溶液制备可能比较难，可通过剧烈震荡或者超声的方式提高或者加速溶解性。不可通过加热助溶。

储存条件

IL-4

GM-CSF

TNF-α

IL-1β

IL-6

·12 months from date of receipt, lyophilized powder stored at -20 to -80℃.

· 3 months, -20 to -80℃ under sterile conditions after reconstitution.

· 1 week, 2 to 8℃ under sterile conditions after reconstitution.

· Please avoid repeated freeze-thaw cycles.

PGE2

-20 °C for 12 months under sterile conditions;

Please avoid repeated freeze-thaw cycles.

产品组分

Component	Reference dosage	S Size(100ml System)	M Size(1000ml System)
IL-4 Protein, Human	50ng/mL	5μg	50μg
GM-CSF Protein, Human	100ng/mL	10μg	100μg
TNF-α Protein, Human	10ng/mL	5μg	10μg
IL-1β Protein, Human	10ng/mL	5μg	10μg
IL-6 Protein, Human	50ng/mL	5μg	50μg
PGE2	1μg/mL	1mg	1mg

Note: S Size some components will remain.

操作步骤

人外周血单核细胞来源树突状细胞的制备：
1、CD14⁺单核细胞分选
1.1复苏冻存的PBMC，室温300g离心5min。弃去上清，使用完全培养基RPMI 1640（含10% FBS和1%双抗）重悬细胞，并进行细胞计数与活率检测（活率应大于95%）；加入CD14阳性分选磁珠（CD14 Nanobeads, human，货号S0K0004）对细胞进行标记、分离并收集CD14⁺细胞。取少量分选后的细胞，使用流式细胞术检测CD14⁺细胞纯度纯度，为确保后续实验质量，建议纯度应大于95%；

2、单核细胞诱导为未成熟树突状细胞
2.1用完全培养基RPMI 1640（含10% FBS和1%双抗）将分选后的CD14+ 细胞浓度调整至1-2×106 cells/mL。按每孔1mL接种于24孔板中，并立即加入重组人细胞因子IL-4（50ng/mL）和GM-CSF（100ng/mL），将24孔板置于37℃、5% CO2的培养箱中开始培养；
2.2 培养48h后，在显微镜下观察细胞状态。若细胞贴壁良好：轻柔吸弃一半旧培养基，再缓慢加入等体积、含有相同浓度IL-4和GM-CSF的新鲜完全培养基；若细胞贴壁不佳或大量悬浮：无需弃去旧液，直接补加适量含有相同浓度细胞因子的新鲜完全培养基。
继续培养：完成换液/补液后，将细胞继续培养72小时。结束后即可获得未成熟树突状细胞。

3、未成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞
3.1 轻柔吹打收集step2的未成熟树突状细胞，300g离心10分钟。弃去上清。用新鲜完全培养基重悬细胞，并将密度调整至5 × 10⁵ cells/mL。将细胞悬液接种至新的24孔板中，并加入成熟诱导因子混合物：TNF-α（10 ng/mL）、IL-1β（10 ng/mL）、IL-6（50 ng/mL）和PGE2（1 μg/mL）。将细胞置于37°C、5% CO₂培养箱中继续培养48小时。培养结束后，即可获得成熟的树突状细胞，用于后续实验。
流式细胞术检测
1. 细胞收集：经细胞因子处理后，收集细胞。
2. 细胞计数：用细胞计数仪计数，并计算细胞总数，300 × g离心5分钟，弃上清，用细胞染色缓冲液（10% FBS或1% BSA PBS）重悬细胞至5-10 × 10⁶ cells/mL。
3. Fc受体阻断：在冰上用100 μL悬浮液（含5-10 × 10⁵个）和1 μL Human FcR Blocking Reagent (human antibodies against CD16/32/64) (STARTER CAT: S0F0012），孵育细胞30分钟，300g离心5分钟，弃上清。

4. 抗体孵育：用100 μl 10% FBS的PBS（或含1% BSA）重悬细胞。分别加入以下抗体单管染色：
APC Rabbit Anti-Human CD80 Antibody (Starter)
APC Rabbit Anti-Human CD86 Antibody (Starter CAT: S0B1658)
Anti-Hu CD83 APC
Brilliant Violet 711™ anti-human CD11c Antibody
Brilliant Violet 421™ anti-human CD14 Antibody
Alexa Fluor® 488 anti-human HLA-DR Antibody
4℃孵育30分钟，300g离心5分钟，弃上清。

5. 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，去除残留的抗体，并再次用PBS重悬。

6. 死活染料染色：每孔加入7-AAD，室温避光孵育5min。

7. 上机检测。