一、血管类器官试剂准备：
1 、包被液制备：用 PBS 或 DMEM/F12 稀释基质胶。
2 、 Collagen I 解冻分装。
3 、配置 Aggregation medium 。
试剂 添加量 体积 Knockout DMEM/F12 77% 38.5ml Knockout 血清替代物 20% 10ml GlutaMax (100x) 1% 0.5ml NEAAs (100x) 1% 0.5ml β -Mercaptoethanol (55mM 母液 ) 100uM 91ul Pen-Strep (100x) 1% 0.5ml
4 ℃储存 2 周
4 、 N2B27-medium
试剂 添加量 体积 DMEM/F12 48% 24ml Neurobasal medium 48% 24ml B27 Supplement (50x) 1x 1ml N2 Supplement (100x) 1x 0.5ml GlutaMax (100x) 0.5x 0.25ml β -Mercaptoethanol (55mM 母液 ) 100uM 91ul Pen-Strep (100x) 1x 0.5ml
4 ℃储存 2 周
5 、 StemPro-34 nutrient Supplement,4 ℃下解冻过夜，无菌分装 1.5ml 离心管， 4 ℃储存可达一年。
6 、 StemPro-34SFM 完全培养基
试剂 体积 34SFM 50ml StemPro-34 nutrient Supplement 1.3ml GlutaMax (100x) 0.5ml Pen-Strep (100x) 0.5ml
二、培养流程：
hiPSC 细胞消化并传代
1 、将 hiPSCs 培养至融合度约为 75-85% ，且大部分无分化状态时，吸出培养基，加 D-PBS 洗一遍，吸出后加入 1 ml Accutase ，并将培养皿放回 37℃ ， 5% CO2 的组织培养箱中，直到所有的细胞都以小细胞块的形式解离 ( 通常需要 5-7 分钟 ) 。
2 、消化完成后，加入 1ml mTeSR1 培养基，轻轻吹下细胞，收集细胞转移至 15ml 离心管中，室温下 300g 离心 3min 。
3 、吸出上清，加 1ml mTeSR1 培养基重悬细胞，按 1:10 的比例传代。
4 、将细胞接种在已包被 Matrigel 的 6 孔板中，每孔加 3ml mTeSR1 培养基（含有 10 μM ROCK inhibitor Y-27632 ），轻轻晃匀，放置在 37℃ ， 5% CO2 的组织培养箱中培养。
EB 的形成
5 、将细胞悬浮在含有 50uM Y27632 的 Aggregation medium 中，调整细胞密度为 3x105 -1x106 cells/well 在超低吸附六孔板中培养。
6 、孵育 1 天，直到形成光滑边界的细胞聚集体（直径 >50-100um ）孵育时间可调整 2-3 天，因聚集能力在 hiPSC 细胞株之间所不同。
7 、在聚集体形成后，用巴氏吸管转移到 15ml 离心管中，自然沉降收集，不建议离心。
中胚层分化 -1
8 、在 N2B27 培养基中添加 12uM CHIR99021 和 30ng/ml BMP4, 用此重悬聚集体，然后转移到超低吸附板中培养。
9 、每天使用 1ml 移液器重悬聚集体，以避免过度融合孵育 3 天以诱导中胚层分化。
10 、在 3 天后将聚集体转移到 15ml 离心管中，等待自然沉降，聚集体沉在底部后，吸弃培养基。
中胚层分化 -2
11 、将聚集体重新悬浮在 N2B27 培养基 +100ng/ml VEGF-121 Protein, Human+2uM Forskolin 中，然后将悬液转移到超低吸附板中，再培养 2 天。
血管网络和类器官的形成
12 、计算用于聚集体嵌入 24 孔板需要的孔数，一个完整的 6 孔板聚集体可嵌入 2 个 24 孔板，对应每个孔 20-30 个聚集体。
13 、准备 5ml 2mg/ml Collagen I solution
试剂 添加量 0.1N NaOH 750ul 10X DMEM 313ul HEPES 63ul 7.5% NaHCO3 49ul GlutaMax (100x) 31ul Ham’s F12 460ul Purecol 3.3ml
14 、计算 Collagen I - Matrigel 溶液总量
每孔使用 0.6ml( 第一层每个孔 0.3ml, 第二层每个孔 0.3ml)
例如： 24 孔培养板 10 个孔需要 6ml Collagen I -Matrigel ，按 Collagen I – Matrigel solution(4:1) 计算，第一层需要 3ml （ 2.4ml Collagen I +0.6ml Matrigel ），第二层需要 3ml （ 2.4ml Collagen I +0.6ml Matrigel ）。
Collagen I solution ，操作需要在冰上。
15 、在 24 孔板中，每孔加入 0.3 mL 第一层胶原（成分为 2 mg/mL Collagen I + 20% Matrigel ）。轻轻旋转孔板使溶液分布均匀。固化第一层胶：将 24 孔板置于 37℃ 条件下固化 2h 。
16 、收集聚集体（通过重力），弃上清用 1 mL StemPro-34 SFM 完全培养基清洗细胞一次。
17 、制备细胞聚集体悬液：计算聚集体的数量，用 Collagen I – Matrigel 溶液重悬聚集体，并置于冰上。
18 、从培养箱中取出含有第一层 Collagen I – Matrigel 的 24 孔板，小心在每个孔中添加 0.3ml 细胞聚集体 -Collagen I – Matrigel ，通过前后摇动板子将聚集体均匀的分散到板子中， 37℃ 条件下固化 2h 。
19 、添加预热的 StemPro-34SFM 完全培养基 +15%FBS+100ng/ml VEGF-121 Protein, Human+100ng/ml + 100ng/ml FGF-basic(154aa) Protein, Human, 以诱导血管分化 ，血管芽通常在 1–3 天内出现。
20 、在培养 3 天后首次换液，之后每隔一天换液一次。再培养 9 天，大约 10 天后，可将血管类器官进行固定染色，或采用其他方案进行下一步分析。
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