小鼠正常肺类器官细胞因子套装

小鼠肺类器官完全培养基的制备：将基础培养基、细胞因子（1-8）及各类添加物按既定比例混合，配制成完全培养基。

1、原代

（1）在超净台里取出肺组织，置于预冷PBS（加青霉素、链霉素、原代抗生素）中清洗。

（2）将清洗后的组织块收集到1.5ml EP管中，使用无菌尖头眼科手术剪将组织块尽量剪碎(匀浆状）。组织剪切程度与消化时间相关，剪切程度越高则消化时间越短，将剪碎后的组织转移至15ml无菌离心管中。

（3）加10倍体积的组织消化液消化，37℃震荡10-30min，消化过程中随时观察情况。当视野中观察到有大量细胞漏出时，可终止消化。

（4）在确认消化完成的组织悬液中，加入胎牛血清（FBS）至终浓度达2-5%或终浓度为0.1%的BSA后吹打混匀。

（5）将组织与细胞悬液过70µm细胞滤网，将过滤后的细胞悬液300g，离心3min，之后弃上清。

（6）若离心后沉淀中观察到明显的红色沉淀（红细胞），加入2ml红细胞裂解液，吹打混匀后放置3min。 300g，离心3min后，弃上清。

（7）适量基础培养基或PBS重悬沉淀。

（8）以合适的比例混合基质胶和细胞，24孔细胞培养板为例，每孔点胶25-30ul基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。

（9）将铺好的培养板放入37℃培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠肺类器官完全培养基进行培养。

2、类器官传代培养

（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，PBS定容到10-14ml ，4℃静置20-30min，每3-5孔为一组。300g，离心3min后，弃上清保留沉淀。

（3）加1ml类器官消化液到收集的沉淀中，吹打混匀，放37℃消化2-3min。加基础培养基终止消化，300g，离心3min弃上清，保留沉淀。

（4）添加适量基质胶重悬类器官，每孔25-30ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠肺类器官完全培养基培养。

3、类器官冻存

（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，PBS定容到10-14ml ，4℃静置20-30min，每3-5孔为一组。300g，离心3min弃上清，保留沉淀。

（3）添加适量类器官冻存液，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例，密度为2-3个孔冻存1管，每管体积1ml。

（4）做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存。

4、类器官复苏

（1）取10ml DMEM/F12基础培养基于15ml离心管中。

（2）从液氮罐中取出冻存的类器官，快速置于 37℃水浴锅中融解。
（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2min内完全融解。
（4）将溶解后的类器官快速转移至15ml 离心管，使用移液器轻轻吹打6-8次，300g，离心3min，然后除去上清液并收集类器官沉淀。

（5）基质胶重悬，每孔25-30ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠肺类器官完全培养基。