人Th2极化套装

Th2 Polarization Kit, human/人Th2极化套装操作流程：

1、包被anti-human CD3 mAb以激活T细胞

1.1使用无菌PBS将anti-human CD3 mAb稀释至工作浓度（5 µg/mL）。

1.2将稀释后的anti-human CD3 mAb按每孔1mL加入24孔细胞培养板中包被，在37°C条件下孵育2小时，或在4°C下孵育过夜。

2、接种细胞并启动Th2极化

2.1次日，吸弃孔内包被液，用预冷的无菌PBS轻柔洗涤孔板2-3次，以去除未结合的抗体。

2.2将CD4⁺ T细胞分选试剂（CD4 Nanobeads，货号S0K0013）分选获得的初始CD4+ T细胞，以 1×10⁶cells/mL的浓度重悬于Th2极化完全培养基中。

Th2极化完全培养基配方：RPMI-1640基础培养基，补充10 % FBS、55 μM β-巯基乙醇、40ng/mL IL-2、30 ng/mLIL-4、10 µg/mL Anti-Human IFN-γ mAb及1 µg/mL anti-human CD28 mAb。

2.3取1mL细胞悬液接种至已包被的24孔板中。置于37°C、5% CO₂的细胞培养箱中培养。

3、培养维持与细胞扩增

3.1培养48小时后，轻柔吹打并收集细胞悬液，300 ×g离心5分钟。

3.2弃上清，用新鲜的Th2极化完全培养基将细胞重悬，并将细胞密度调整至 3×10⁵ cells/mL，重新接种至新孔板中继续培养。

3.3此后，每12小时在倒置显微镜下观察细胞密度及状态。若细胞密度过高（例如 >2×10⁶ cells/mL），则进行半量换液或按适当比例将细胞分至新的孔中，并补充新鲜Th2极化完全培养基（不用加anti-human CD28 mAb）以维持细胞最佳生长状态。

4、细胞再刺激与胞内因子捕获

培养至第5天，收集细胞，用预冷的PBS洗涤一次后，使用含 10 ng/mL PMA、1 µg/mL Ionomycin及10 µg/mL Brefeldin A 的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，调整密度至 1×10⁶cells/mL，于37°C、5% CO₂培养箱中避光共刺激孵育5小时。

阴性对照组（Th0）设置

为评估极化的特异性，平行设置Th0阴性对照组。其流程与上述Th2诱导组基本相同，主要区别在于所使用的培养基不同：

1、Th0维持培养基配方：RPMI-1640基础培养基，补充10 % FBS，55 μM β-巯基乙醇，10μg/mL Anti-human IL-4 mAb，10μg/mL Anti-Human IFN-γ mAb，40ng/mL IL-2及1 µg/mL anti-human CD28 mAb。

2、不添加极化细胞因子：该培养基中不添加极化细胞因子。

除上述差异外，细胞接种、换液、密度监控均与Th2诱导组相同。

流式细胞术检测
1. 收集细胞：细胞诱导后，弃培养基上清，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将贴壁细胞用PBS轻轻吹打重悬；

2. 计数：用细胞计数仪计数并计算细胞总数，300×g，离心5min，弃上清；

3. 死活染料染色：按照100μL/1e6浓度加入稀释好的死活染料Fixable Viability Dye 452（S0D0021）(稀释方法参考说明书）；

4. 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，300×g，离心5min，去除残留的死活染料；

5. 细胞固定：用PBS将细胞按照1e7/ml重悬，100μL/孔加至96孔板，300×g，离心5min，弃上清；每孔加入200μl 4% PFA，室温避光放置15min；

6. 洗涤细胞：300×g，离心5min，弃上清；每孔加200μL PBS，300×g，离心5min洗涤细胞，去除残留的固定剂；

7. 细胞破膜：每孔加入200μL fixation/permeabilization solution（BD 554714），4~8℃冰箱孵育30min；

8. 细胞封闭：每孔加入100μL 1×BD Perm/Wash™ Buffer，并加入Human IgG进行细胞封闭（步骤7与步骤8可同时进行），随后300×g，离心5min，弃上清；

9. 孵育抗体：每孔加入100μL 1×BD Perm/Wash™ Buffer并加入孵育抗体PE/Dazzle™ 594 anti-human IL-4 Antibody (Biolegend 500831)(抗体用量参考说明书）；

10. 洗涤细胞：300×g，离心5min，弃上清；每孔加200μL PBS，300×g，离心5min洗涤细胞，去除残留抗体，随后用100μL-200μL重悬细胞；

11. 上机检测。