UniOne^® TR-FRET Human cGMP Detection Kit

价格￥7,880.00 （供应商现货： 3-5个工作日）

货号 UA086127

规格

500T100T2500T10000T

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产品介绍

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背景介绍

试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），可精确测定细胞产生的cGMP。该方法是实现简单快速筛选调节磷酸二酯酶活性的分子的高通量形式。
如图所示，标记了Biotin的cGMP可被链霉亲和素（SA）结合，Eu标记的抗cGMP抗体（TR-FRET 供体）和 Ac 标记的抗 Tag2 抗体（TR-FRET受体）分别结合cGMP和Biotin，供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET），使受体抗体特异性发射665nm波长信号。当细胞样本或标曲中的cGMP存在时，与标记了Biotin的cGMP竞结合Eu标记的cGMP抗体，从而使FRET信号减小，该特定信号与Eu标记的cGMP抗体、biotin 标记的cGMP 和 SA 的相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤。

产品规格

产品组分

组分	浓度	100T	500T	2500T	10000T	储存温度
Biotin-cGMP protein	100×	5μL	12.5μL	62.5μL	250μL	-80℃
cGMP calibrator	500μM	5μL	5μL	25μL	100μL	-80℃
Anti-cGMP Eu antibody	100×	5μL	25μL	125μL	500μL	-80℃
SA-Ac	12.5×	20μL	100μL	500μL	2mL	-80℃
Lysis & Detect Buffer	1×	2mL	10mL	50mL	200mL	-80℃
Stimulation Buffer（无IBMX）	1×	2mL	10mL	50mL	200mL	-80℃

操作步骤

1、试剂准备

1.1 使用前将所有试剂室温融化。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如下表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。

表1. 试剂配制及用量

试剂名称	配置	每个检测孔用量μL
Anti-cGMP Eu antibody	取25μL Anti-cGMP Eu antibody原液，Lysis & Detect Buffer稀释至2.5mL ,混匀备用。	5μL
cGMP Ac Mix	取12.5μL Biotin-cGMP protein原液，Lysis & Detect Buffer稀释至1.25mL ,混匀备用；取100 μL SA-Ac 原液，加入Lysis & Detect Buffer 1.25mL ,混匀备用。将稀释后的Biotin-cGMP protein和SA-Ac 1:1等比例混匀，即为cGMP Ac Mix。	5μL

1.2 待测样品梯度稀释

请根据实验情况配制，以下内容仅供参考。

以cGMP calibrator为例，稀释液为Stimulation Buffer，且待测样本根据实际浓度调整。

表2. cGMP calibrator配置表

	终浓度（nM）	配制浓度（nM）	配置方法
1	1,250.000	5,000.000	1μL 500μM 母液+99μL Stimulation Buffer
2	416.667	1,666.667	20μL ① +40μL Stimulation Buffer
3	138.889	555.556	20μL ② +40μL Stimulation Buffer
4	46.296	185.185	20μL ③ +40μL Stimulation Buffer
5	15.432	61.728	20μL ④ +40μL Stimulation Buffer
6	5.144	20.576	20μL ⑤ +40μL Stimulation Buffer
7	1.715	6.859	20μL ⑥ +40μL Stimulation Buffer
8	0.572	2.286	20μL ⑦ +40μL Stimulation Buffer
9	0.191	0.762	20μL ⑧+40μL Stimulation Buffer
10	0.064	0.254	20μL ⑨+40μL Stimulation Buffer
11	0.021	0.085	20μL ⑩+40μL Stimulation Buffer
Blank	0	0	40μL 1× Stimulation Buffer

1.3 基于细胞实验的前期处理

①Stimulation Buffer用于稀释细胞和刺激药物；试剂盒提供的Stimulation Buffer为未添加IBMX的溶液，如实验目的为定量细胞中cGMP的终浓度，有必要添加合适浓度的IBMX，防止cGMP降解；如实验目的为评价PDE酶抑制剂的性能，则不能添加IBMX。

②在进行正式实验前，需根据细胞和研究药物的特性，探索每孔加入细胞的数量，以及细胞与药物的孵育时间，确保细胞产生的cGMP水平处于校准曲线的线性范围。

2、加样及对照

2.1 cGMP标曲：5μL 梯度稀释的cGMP参考品，5μL Stimulation Buffer，5μL Anti-cGMP Eu antibody 工作液, 孵育10min后加入5μL cGMP Ac Mix；

2.2 待测样本：5μL 梯度稀释待测样本，5μL Stimulation Buffer，5μL Anti-cGMP Eu antibody 工作液, 孵育10min后加入5μL cGMP Ac Mix；

2.3 基于细胞的实验：根据预实验确定加入细胞的浓度，每孔加入5μL细胞，5μL梯度稀释的药物，根据预实验确定的药物刺激时间，孵育后加入5μL Anti-cGMP Eu antibody 工作液，室温孵育10min，再加入5μL cGMP Ac Mix；

2.4 阴性对照孔（NC）：5μL Stimulation Buffer代替待测样本或5μL药物未处理过的细胞。