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试剂盒采用均相时间分辨荧光技术(TR-FRET），用于测定Human PCSK9(D347Y) 与Human LDLR 之间的相互作用，PCSK9(D347Y)是PCSK9的突变体，与LDLR具有更高的亲和力。该方法可以实现简单快速的高通量鉴定抑制剂和抗体阻断剂。
如图所示，PCSK9(D347Y)与LDLR之间的相互作用是通过使用Eu标记的抗Tag1 抗体(TR-FRET 供体)和 Ac标记的Tag2抗体(TR-FRET受体）进行检测。由于PCSK9(D347Y) 与LDLR结合介导供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移(FRET） ，使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。所筛选药物，如Pep 2-8阻断PCSK9(D347Y)与LDLR的结合，使FRET信号无法产生，所筛选药物对PCSK9(D347Y)和LDLR阻断效果越强，信号越低。信号与PCSK9(D347Y)与LDLR相互作用的程度成正比。无需洗涤步骤。
来源
Human储存条件
-80℃
组分
浓度
100T
500T
2500T
10000T
储存温度
Tag1-LDLR protein
100×
5μL
20μL
100μL
400μL
-80℃
Tag2-PCSK9(D347Y) protein
100×
5μL
20μL
100μL
400μL
-80℃
Anti-Tag1 Eu antibody
50×
10μL
50μL
250μL
1000μL
-80℃
Anti-Tag2 Ac antibody
12.5×
40μL
200μL
1mL
4mL
-80℃
Detection buffer
1×
2mL
14mL
60mL
240mL
-80℃
1、试剂准备
1.1 使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。
表1. 试剂配制
试剂名称
配置
每个检测孔用量μL
待测样品稀释
使用稀释至1×的检测缓冲液进行待测样品的配制。若样品的储液为DMSO，建议保持体系中DMSO 含量一致，且最高不超过2%。 2
Tag1-LDLR protein
取20μL Tag1-LDLR protein原液，1× Detection buffer稀释至2mL, 混匀备用。 4
Tag2-PCSK9(D347Y) protein
取20μL Tag2-PCSK9(D347Y) protein原液，1×Detection buffer稀释至2mL, 混匀备用。 4
Antibody Mix
取50μL Anti-Tag1 Eu antibody 原液，加入 1×Detection buffer 2.45mL, 混匀；取200μL Anti-Tag2 Ac antibody 原液，加入 1× Detection buffer 2.3mL, 混匀；Anti-Tag1 Eu antibody与Anti-Tag2 Ac antibody 1:1体积混合，得到Antibody Mix。 10
1.2 待测样品梯度稀释
以Pep 2-8为例，稀释液为1× Detection buffer，为降低基质效应干扰的影响，推荐使用与待测样品基质相同的溶液稀释；且待测样本根据实际浓度调整。
表2. Pep 2-8配置表（根据实际情况调整）
Pep 2-8配置浓度（nM）
Pep 2-8终浓度（nM）
配置方法
1 1000000
100000
12μL 1mM Pep 2-8
2 333333.33
33333.33
6μL ① +12μL 1× Detection buffer
3 111111.11
11111.11
5μL ② +10μL 1× Detection buffer
4 37037.04
3703.70
5μL ③ +10μL 1× Detection buffer
5 12345.68
1234.57
5μL ④ +10μL 1× Detection buffer
6 4115.23
411.52
5μL ⑤ +10μL 1× Detection buffer
7 1371.74
137.17
5μL ⑥ +10μL 1× Detection buffer
8 457.25
45.72
5μL ⑦ +10μL 1× Detection buffer
9 152.42
15.24
5μL ⑧ +10μL 1× Detection buffer
Blank
0
0
10μL 1× Detection buffer
2、加样及对照
2.1 待测样本：2μL 梯度稀释待测样本，4μL Tag2-PCSK9(D347Y) protein, 4μL Tag1-LDLR protein工作液，10μL Antibody Mix，依次加入384浅孔板中。
2.2 空白对照孔（Blank）：2μL 1× Detection buffer代替待测样本；
2.3 Eu对照孔（NC）：10μL 1× Detection buffer加10μL Antibody Mix。
所有样本加完后，离心，盖封板膜，室温孵育2小时。
待测样本
空白对照孔（Blak）
Eu对照孔（NC）
第一步
2μL
梯度稀释待测样本
2μL
1× Detection buffer
10μL 1× Detection buffer
+10μL Antibody Mix
4μL Tag2-PCSK9(D347Y) protein
封板，1000rpm，离心1min混匀，
室温孵育10min
第二步
4μL Tag1-LDLR protein
10μL Antibody Mix
封板，1000rpm，离心1min混匀，室温孵育120min，读板
3、检测
在兼容TR-FRET的酶标仪上检测。激发光为320/340nm，检测620nm和665nm的发射波长。
【结果计算】
1) 计算信号值（Ratio）：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘10000。
Ratio = (665/620) ×10000
2) 根据信号值计算Net signal：
Net signal = (Std-NC)/NC×100
3) 计算CV（%）：
CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio × 100%
Ratio × 100%
【数据示例】
以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因读板仪器而异。
注：推荐微孔板（384孔板，白色，浅孔）
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