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试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET） ，用于测定带His标签的蛋白 。该试剂盒既可用于确认蛋白的His标签基序是否可被抗His抗体识别，也可用于估算His标记蛋白的浓度。
如图所示，带His标签的蛋白被标记了Accepter，即Ac-Protein His Tag，识别His标签的抗体被标记了Eu，即Eu-anti-His，抗体结合蛋白的His标签后，供体和受体的距离靠近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET） ，使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。当其他带His标签的蛋白存在时，会与Ac-Protein His Tag竞争结合Eu-anti-His，导致FRET信号无法产生，其他His标签蛋白浓度越高，与Ac-Protein His Tag竞争结合Eu-anti-His的能力越强，信号越低。信号与Ac-Protein His Tag和Eu-anti-His的结合成正比，无需洗涤步骤。
来源
Human储存条件
-80℃
组分
浓度
100T
500T
2500T
10000T
储存温度
His Tag Control
1mM
10μL
20μL
100μL
400μL
-80℃
Eu-anti-His
100 ×
10μL
50μL
250μL
1000μL
-80℃
Ac-Protein His Tag
100×
40μL
200μL
1mL
4mL
-80℃
Detection buffer
10 ×
400μL
2mL
10mL
40mL
-80℃
1、试剂准备
1.1 使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。
表1. 试剂配制
试剂名称
配置
每个检测孔用量μL
Detection buffer
取2mL 10 × Detection buffer加入18mL去离子水，稀释至1×，混匀备用。 -
Eu-anti-His
取25μL 100 × Eu-anti-His原液，加入到2.745mL 1×Detection buffer稀释至1×，混匀备用。 5μL
Ac-Protein His Tag
取25μL 100 × Ac-Protein His Tag原液，加入到2.745mL 1×Detection buffer稀释至1×，混匀备用。 5μL
1.2 待测样品梯度稀释
以His Tag Control为例，稀释液为1× Detection buffer，为降低基质效应干扰的影响，推荐使用与待测样品基质相同的溶液稀释；且待测样本根据实际浓度调整。
表2. 阳性药His Tag Control梯度稀释（根据实际情况调整）
His Tag Control终浓度（nM）
His Tag Control配制浓度（nM）
配置方法
①
5000
10000
1μL 1mM 母液+99μL 1× Detection buffer
②
1666.67
3333.33
10μL ① +20μL 1× Detection buffer
③
555.56
1111.11
10μL ② +20μL 1× Detection buffer
④
185.19
370.37
10μL ③ +20μL 1× Detection buffer
⑤
61.73
123.46
10μL ④ +20μL 1× Detection buffer
⑥
20.58
41.15
10μL ⑤ +20μL 1× Detection buffer
⑦
6.86
13.72
10μL ⑥ +20μL 1× Detection buffer
⑧
2.29
4.57
10μL ⑦ +20μL 1× Detection buffer
⑨
0.76
1.52
10μL ⑧ +20μL 1× Detection buffer
⑩
0.25
0.51
10μL ⑨ +20μL 1× Detection buffer
Blank
0
0.0
20μL 1× Detection buffer
2、加样及对照
2.1 样本孔（Sample）：10μL待测样本（梯度稀释），5μL Eu-anti-His工作液，5μL Ac-Protein His Tag，依次加入384浅孔板中。
2.2 最大信号对照：10μL 1×Detection buffer，5μL Eu-anti-His工作液，5μL Ac-Protein His Tag，依次加入384浅孔板中。
2.3 阴性对照（Negative control）： 15μL Detection buffer, 5μL Eu-anti-His工作液，依次加入384浅孔板。
所有样本加完后，离心，盖封板膜，室温孵育2小时。
样本（Sample）
最大信号对照
阴性对照（NC）
第一步
10μL 待测样本
10μL 1×Detection buffer
15μL 1×Detection buffer + 5μL Eu-anti-His工作液
5μL Eu-anti-His工作液
室温孵育10min
第二步
5μL Ac-Protein His Tag
盖封板膜 ，室温孵育2h
3、检测
在兼容TR-FRET的酶标仪上检测。激发光为320/340nm，检测620nm和665nm的发射波长。
【结果计算】
1) 计算信号值（Ratio）：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘10000。
Ratio = (665/620) ×10000
2) 根据信号值计算Net signal：
Net signal = (Std-NC)/NC×100
3) 计算CV（%）：
CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio × 100%
【数据示例】
以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因读板仪器而异。
名称
分子量kDa
His
IC50
His-Peptide
3.328
10×His
44.29
His-Protein 1
20
10×His
1.817
His-Protein 2
49
10×His
6.671
His-Protein 3
62
6×His
138
His-Protein 4
180
6×His
101.6
注：推荐微孔板（384孔板，白色，浅孔）
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