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试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），用于测定分子胶 SJF620 及待检测化合物介导的 DDB1/CRBN 复合体与 BTK 相互作用。该方法是实现简单快速的检测能够介导 DDB1/CRBN 复合体与 BTK 相互作用的小分子的高通量形式。
如所示，DDB1/CRBN 和 BTK 之间的相互作用是通过使用Eu标记的抗Tag1抗体（TR-FRET 供体）和 Accepter 标记的抗 Tag2 抗体（TR-FRET受体）检测的。由于分子胶 SJF620 介导了 DDB1/CRBN 与 BTK 的相互作用，供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET），使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。该特定信号与 SJF620 和 DDB1/CRBN、BTK 的相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。
来源
Human储存条件
-80℃
组分
浓度
100T
500T
2500T
10000T
储存温度
Tag1-DDB1/CRBN protein
50×
8μL
40μL
200μL
800μL
-80℃
Tag2- BTK protein
20×
20μL
100μL
500μL
2mL
-80℃
SJF620
1mM
5μL
10μL
50μL
200μL
-80℃
Anti-Tag1 Eu antibody
50×
10μL
50μL
250μL
1mL
-80℃
Anti-Tag2 Ac antibody
12.5×
40μL
200μL
1mL
4mL
-80℃
Detection buffer
10×
400μL
2mL
10mL
40mL
-80℃
【实验流程及操作】
1、试剂准备
1.1 使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。
表1. 试剂配制
试剂名称
配置
每个检测孔用量μL
Detection buffer
取2mL 10× Detection buffer1加入18mL去离子水，稀释至1×，混匀备用。
-
SJF620
按照反应体系，化合物用1×Detection buffer稀释到待测浓度。
保证所有检测孔中DMSO的含量一致。
2
Tag1-DDB1/CRBN protein
取40μL Tag1-DDB1/CRBN protein原液，1× Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。
4
Tag2- BTK protein
取100μL Tag2- BTK protein原液，1×Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。
4
Antibody Mix
取50μL Anti-Tag1 Eu antibody 原液，加入 1×Detection buffer 2.45mL, 混匀；取200μL Anti-Tag2 Ac antibody 原液，加入 1× Detection buffer 2.3mL, 混匀；二者1:1混合为Antibody Mix。
10
1.2 待测样品梯度稀释
以SJF620 为例，稀释液为1× Detection buffer，为降低基质效应干扰的影响，推荐使用与待测样品基质相同的溶液稀释；且待测样本根据实际浓度调整。
表2. 阳性药物梯度稀释（根据实际情况调整）
SJF620终浓度（nM）
SJF620配制浓度（nM）
配置方法
1
10000.00
100000.00
2μL 1mM 母液+18μL 1× Detection buffer
2
2500.00
25000.00
5μL ① +15μL 1× Detection buffer
3
625.00
6250.00
5μL ② +15μL 1× Detection buffer
4
156.25
1562.50
5μL ③ +15μL 1× Detection buffer
5
39.06
390.63
5μL ④ +15μL 1× Detection buffer
6
9.77
97.66
5μL ⑤ +15μL 1× Detection buffer
7
2.44
24.41
5μL ⑥ +15μL 1× Detection buffer
8
0.61
6.10
5μL ⑦+15μL 1× Detection buffer
9
0.15
1.53
5μL⑧+15μL 1× Detection buffer
10
0.04
0.38
5μL ⑨+15μL 1× Detection buffer
Blank
0
0
15μL 1× Detection buffer
2、加样及对照
阳性药标曲
待测样本
Blank
NC
2μL
梯度稀释SJF620
2μL
梯度稀释待测样本
2μL
1× Detection buffer
10μL 1× Detection buffer+10μL Antibody Mix
4μL Tag1- CRBN protein
4μL Tag2-BTK protein
10μL Antibody Mix
用封板膜封住板孔，室温孵育2小时；
2.1 待测样本：2μL梯度稀释待测样本，4μL Tag1-DDB1/CRBN protein工作液，4μL Tag2-BTK protein工作液，10μL混匀的Antibody Mix（Tag2-BTK protein可与Antibody Mix按比例混合后加入），依次加入384浅孔板中。
2.2 阳性药标曲：2μL 梯度稀释SJF620 ，4μL Tag1-DDB1/CRBN protein工作液，4μL Tag2-BTK protein工作液，10μL Antibody Mix。
2.3 Blank：2μL 1× Detection buffer代替待测样本；
2.4 阴性对照孔（NC）：10μL 1× Detection buffer加10μL Antibody Mix。
所有样本加完后，离心，盖封板膜，室温孵育2小时。
3、检测
在兼容TR-FRET的酶标仪上检测。激发光为320/340nm，检测620nm和665nm的发射波长。
【结果计算】
1) 计算信号值（Ratio）：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘10000。
Ratio = (665/620) ×10000
2) 根据信号值计算Net signal：
Net signal = (Std-NC)/NC×100
3) 计算CV（%）：
CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio × 100%
【数据示例】
以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因读板仪器而异。
注：推荐微孔板（384孔板，白色，浅孔）
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