UniOne^® TR-FRET Human cAMP Hirange Detection Kit

价格￥2,800.00 （ 1-2周）

货号 UA086053

规格

250T1000T5000T20000T

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产品介绍

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背景介绍

试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），可精确测定细胞产生的cAMP。该方法可快速检测Gs或Gi信号通路抑制或激活时cAMP的积累变化。
如图所示，Eu标记的抗cAMP抗体（TR-FRET 供体）和 Ac 标记的cAMP （TR-FRET受体）直接结合，供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET），使受体抗体特异性发射665nm波长信号。当细胞样本或标曲中的cAMP存在时，与标记了Ac的cAMP竞争结合Eu标记的cAMP抗体，从而使FRET信号减小，该特定信号与Eu标记的cAMP抗体和Ac 标记的cAMP的相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤。

产品规格

产品组分

组分	浓度	100T	500T	2500T	10000T	储存温度
cAMP calibrator	4mM	5μL	5μL	25μL	100μL	-80℃
Anti-cAMP Eu antibody	100×	5μL	25μL	125μL	500μL	-80℃
cAMP-Ac	100×	5μL	25μL	125μL	500μL	-80℃
Lysis & Detect Buffer	1×	2mL	10mL	50mL	200mL	-80℃
Stimulation Buffer（无IBMX）	1×	2mL	10mL	50mL	200mL	-80℃

注意：所有首次解冻后立即分装，并按建议储存温度保存，避免稀释后储存及反复冻融。

操作步骤

1、试剂准备

1.1 使用前将所有试剂室温融化。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如下表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。

表1. 试剂配制及用量

试剂名称	配置	每个检测孔用量μL
Anti-cAMP Eu antibody	取25μL Anti-cAMP Eu antibody原液，Lysis & Detect Buffer稀释至2.5mL ,混匀备用。	5μL
cAMP-Ac	取25μL cAMP-Ac原液，Lysis & Detect Buffer稀释至2.5mL ,混匀备用；	5μL

1.2 待测样品梯度稀释

请根据实验情况配制，以下内容仅供参考。

以cAMP calibrator为例，稀释液为Stimulation Buffer，且待测样本根据实际浓度调整。

表2. cAMP calibrator配置表

	配置浓度（nM）	终浓度（nM）	配置方法
1	40,000.000	10,000.000	1μL 4mM 母液+99μL Stimulation Buffer
2	13,333.333	3,333.333	20μL ① +40μL Stimulation Buffer
3	4,444.444	1,111.111	20μL ② +40μL Stimulation Buffer
4	1,481.481	370.370	20μL ③ +40μL Stimulation Buffer
5	493.827	123.457	20μL ④ +40μL Stimulation Buffer
6	164.609	41.152	20μL ⑤ +40μL Stimulation Buffer
7	54.870	13.717	20μL ⑥ +40μL Stimulation Buffer
8	18.290	4.572	20μL ⑦ +40μL Stimulation Buffer
9	6.097	1.524	20μL ⑧+40μL Stimulation Buffer
10	2.032	0.508	20μL ⑨+40μL Stimulation Buffer
11	0.677	0.169	20μL ⑩+40μL Stimulation Buffer
⑫	0.226	0.056	20μL ⑪+40μL Stimulation Buffer
Blank	0	0	40μL 1× Stimulation Buffer

1.3 基于细胞实验的前期处理

①Stimulation Buffer用于稀释细胞和刺激药物；试剂盒提供的Stimulation Buffer为未添加IBMX的溶液，根据实验目的，添加合适浓度的IBMX，防止cAMP降解；

②在进行正式实验前，需根据细胞和研究药物的特性，探索每孔加入细胞的数量，以及细胞与药物的孵育时间，确保细胞产生的cAMP水平处于校准曲线的线性范围。

2、加样及对照

2.1 cAMP标曲：5μL 梯度稀释的cAMP参考品，5μL Stimulation Buffer，5μL Anti-cAMP Eu antibody 工作液, 孵育10min后加入5μL cGMP-Ac；

2.2 待测样本：5μL 梯度稀释待测样本，5μL Stimulation Buffer，5μL Anti-cAMP Eu antibody 工作液, 孵育10min后加入5μL cAMP-Ac；

2.3 基于细胞的实验：根据预实验确定加入细胞的浓度，每孔加入5μL细胞，5μL梯度稀释的药物，根据预实验确定的药物刺激时间，孵育后加入5μL Anti-cAMP Eu antibody 工作液，室温孵育10min，再加入5μL cAMP-Ac；

2.4 阴性对照孔（NC）：5μL Stimulation Buffer代替待测样本或5μL药物未处理过的细胞。