UniOne^® TR-FRET Human CRBN Ligand Screening Assay Kit

Datasheet COA

价格￥4,380.00 （供应商现货： 3-5个工作日）

货号 UA086023

规格

100T500T2500T10000T

数量

产品介绍

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背景介绍

人Cereblon (CRBN) 蛋白配体结合检测试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），可用于CRBN抑制剂或配体的结合检测和筛选，是实现快速检测CRBN抑制剂或配体的高通量筛选形式，基本原理如下图所示。
Eu标记的检测试剂（Anti-Tag1-Eu）特异识别结合Tag1-CRBN/DDB1蛋白，受体标记的沙利度胺（Thalidomide-Ac）与CRBN结合，使Eu和Ac靠近，在外部光源的激发下，供体与受体之间发生能量共振转移，检测665nm波长的信号强度即可测定CRBN/DDB1与Thalidomide-Ac的结合。反应体系中加入的CRBN配体或PROTAC竞争结合CRBN/DDB1，使信号降低，配体或PROTAC浓度升高，信号降低。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。

产品规格

来源

Human
储存条件

-80°C

产品组分

Component	Concentration	Volume(100T)	Volume(500T)	Volume(2500T)	Volume(10000T)	Storage Condition
Thalidomide	10 mM in DMSO	5 μL	5 μL	25 μL	100 μL	-80℃
Tag1-CRBN/DDB1	100×	5μL	25μL	125μL	500 μL	-80℃
Thalidomide-Ac	100×	5μL	25μL	125μL	500 μL	-80℃
Anti-Tag1-Eu	50×	10μL	50μL	250 μL	1000 μL	-80℃
Detection Buffer	10×	250μL	1.2mL	6mL	21 mL	-80℃

*Reagents should be protected from repeated freeze-thaw cycles. It is recommended to aliquot after the first thaw and store according to the storage conditions. The shelf life is one year.
*Thaw reagents on ice before use and equilibrate to room temperature.
*Prepare all reagent working solutions freshly before use.

操作步骤

试剂配置及用量
试剂配置及用量表

名称	试剂配置	每孔用量 (μL)
标准品或待测样品	使用稀释至1X的检测缓冲液进行待测样品和标准品的配制。若样品的储液为DMSO，建议保持体系中DMSO 含量一致，且最高不超过2%。标准品稀释见下表。	5
Tag1-CRBN/DDB1	母液为100X, 使用1X检测缓冲液100倍稀释后，混匀备用，例如，将2μL Tag1-CRBN/DDB11母液加入到198 μL 1X检测缓冲液中，即为200μL蛋白工作液。。	5
Thalidomide-Ac	母液浓度为100X，使用1X检测缓冲液100倍稀释后，每孔加样5μL，例如，将2 μL Thalidomide-Ac母液加入到198 μL 1X检测缓冲液中，即为200μL工作液。	5
Anti-Tag1-Eu	母液浓度为50X，使用1X检测缓冲液50倍稀释后，每孔加样5μL，例如，将2 μL Anti-Tag1-Eu母液加入到98 μL 1X检测缓冲液中，即为100μL工作液。	5

试剂盒中Thalidomide 标准品为10mM DMSO 母液。请根据实验情况配制标准品总量，以下内容仅供参考。

使用稀释至1X的检测缓冲液进行待测样品和标准品的配制。若样品的储液为DMSO，建议保持体系中DMSO 含量一致，(检测缓冲液中不含DMSO，请根据标准品或待测样品稀释情况向1X检测缓冲液中添加DMSO)且最高不超过2%。

标准品配置表

Standard	配制方法	配制浓度（nM）	终浓度（nM）
Std 10	1 μL标准品母液+ 82.3μL检测缓冲液	120000	30000
Std 9	10 μL std 10 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	40000	10000
Std 8	10 μL std 9 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	13333.3	3333.33
Std 7	10 μL std 8 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	4444.4	1111.11
Std 6	10 μL std 7 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	1481.5	370.37
Std 5	10 μL std 6 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	493.8	123.46
Std 4	10 μL std 5 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	164.6	41.15
Std 3	10 μL std 4 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	54.9	13.72
Std 2	10 μL std 3 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	18.3	4.57
Std 1	10 μL std 2 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	6.1	1.52
0	20μL 检测缓冲液	0	0

实验流程
将试剂配制后，轻柔混匀备用，按照下表进行加样。

	标准品	待测样品	阴性对照
Step1	5 μL Tag1-CRBN/DDB1		5 μL 检测缓冲液
Step2	5 μL 稀释后的标准品	5 μL 待测样品(4X)	5 μL 检测缓冲液
离心	封板，1000rpm，离心1min混匀，室温孵育30min
Step3	10μL Thalidomide-Ac + Anti-Tag1-Eu 1:1 Mix
读板	封板，1000rpm，离心1min混匀，室温孵育120min，读板

*孵育时用封板膜封板，防止试剂蒸发。

数据处理
计算每个孔位的受体和供体的发射信号的比值：
Ratio=（Signal 665nm/Signal 620nm）×10⁴
计算CV（%）：CV（%）=Ratio Deviation/Mean Ratio×100%

生物活性
- （1）标准曲线*
  由图表可知，由于Thalidomide标准品与Thalidomide-Ac竞争与CRBN/DDB1的结合，使信号值降低。
- （2）结合活性和抑制剂验证
  Thalidomide-Ac与CRBN/DDB1结合验证，由结果可知，蛋白浓度不变时，检测信号随着Thalidomide-Ac浓度的升高而增加。Lenalidomide和Pomalidomide以及PROTAC BET Degrader-1可以竞争Thalidomide-Ac与CRBN/DDB1的结合。

UniOne® TR-FRET Human CRBN Ligand Screening Assay Kit

来源

储存条件

生物活性

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