产品中心药物筛选试剂盒 UniOne®TR-FRET

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UniOne^® TR-FRET Human BCL6/CRBN PROTAC Binding Kit

Datasheet COA

价格￥13,080.00 （ 1-2周）

货号 UA086021

规格

500T2500T10000T

数量

产品介绍

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背景介绍

试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），用于测定分子胶 ARV-393 及待检测化合物介导的 DDB1/CRBN 复合体与 BCL6 相互作用。该方法是实现简单快速的检测能够介导 DDB1/CRBN 复合体与 BCL6 相互作用的小分子的高通量形式。
如所示，DDB1/CRBN 和 BCL6 之间的相互作用是通过使用Eu标记的抗Tag1抗体（TR-FRET 供体）和 Accepter 标记的抗 Tag2 抗体（TR-FRET受体）检测的。由于分子胶 ARV-393 介导了 DDB1/CRBN 与 BCL6 的相互作用，供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET），使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。该特定信号与 ARV-393 和 DDB1/CRBN、BCL6 的相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。

产品规格

来源

Human
储存条件

将试剂盒保存在-80°C或以下。在适当的储存条件下，试剂保持稳定直到标签上标明的有效期。试剂一旦解冻， BCL6和CRBN原液可以再冻融一次；标签抗体溶液可以再冻融一次。为了避免反复冻融，建议将剩余的原液分装到一次性容器中用于-80°C储存。解冻后的稀释液和检测缓冲液可储存在2-8°C。

产品组分

Table 1. Kit Components and Storage Conditions

Component	Concentration	100 TESTS	500 TESTS	2500 TESTS	10000 TESTS	Storage Temperature
Tag1-DDB1/CRBN protein,	50×	10μL	50μL	250μL	1000μL	-80℃
Tag2- BCL6 protein	50×	10μL	50μL	250μL	1000μL	-80℃
ARV-393 (100 μM)	100×	5μL	25μL	125μL	500μL	-80℃
Anti-Tag1 Eu dye antibody	50×	10μL	50μL	250μL	1000μL	-80℃
Anti-Tag2 Ac antibody	20×	25μL	125μL	625μL	2500μL	-80℃
Detection buffer	1×	2ml	10ml	10mL	40mL	-80℃

操作步骤

1试剂准备

使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20uL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。

表2. 试剂配置及用量

试剂名称	配置	用量（μL）
ARV-393	按照反应体系，化合物用Detection buffer稀释到待测浓度。保证所有检测孔中DMSO的含量一致。	2
Tag1-DDB1/CRBN protein,	取80μL Tag1-DDB1/CRBN protein原液， Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。	4
Tag2- BCL6 protein	取20μL Tag2- BRD4 protein原液，Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。	4
Antibody Mix	取50μL Anti-Tag1 Eu dye antibody，用Detection buffer稀释至2500μL，混匀；取50μL Anti-Tag2 LA，用Detection buffer稀释至2500μL，混匀，1:1混合为Antibody Mix。	10

1.1 待测样品梯度稀释

使用1×Detection buffer进行待测样品和标准品的配制。若样品的储液为DMSO，建议保持体系中DMSO 含量一致，(检测缓冲波中不含DMSO，请根据标准品或待测样品稀释情况向1×Detection buffer中添加DMSO)目最高不超过2%。试剂盒中ARV-393标准品为100μM DMSO 母液。请根据实验情况配制标准品总量，以下内容仅供参考。

表3. ARV-393梯度稀释

	ARV-393终浓度（nM）	ARV-393配制浓度（nM）	配置方法
①	400	4000	4μL 100μM 母液+96μL Detection buffer
②	200	2000	50μL ① +50μL Detection buffer (1%DMSO)
③	100	1000	50μL ② +50μL Detection buffer (1%DMSO)
④	50	500	50μL ③ +50μL Detection buffer (1%DMSO)
⑤	25	250	50μL ④ +50μL Detection buffer (1%DMSO)
⑥	12.5	125	50μL ⑤ +50μL Detection buffer (1%DMSO)
⑦	6.25	62.5	50μL ⑥ +50μL Detection buffer (1%DMSO)
⑧	3.125	31.25	50μL ⑦ +50μL Detection buffer (1%DMSO)
⑨	1.5625	15.625	50μL ⑧ +50μL Detection buffer (1%DMSO)
⑩	0.78125	7.8125	50μL ⑨ +50μL Detection buffer (1%DMSO)
Blank	0	0	100μL Detection buffer (1%DMSO)

2 加样及对照

2.1 实验孔加样顺序：4uL Tag1-DDB1/CRBN protein，4uL L Tag2- BCL6 protein，2uL ARV-393 或待检测化合物，10uL混匀的Antibody Mix，依次加入384浅孔板中。

2.2 阴性对照孔（Blank）： ARV-393 或待检测化合物替换为2uL相同百分含量的DMSO溶液。

2.3 NC：15uL Detection buffer加5uL稀释后的Anti-Tag1 Eu dye antibody。

表4. 加样及对照

	阴性对照	阳性对照	样本	NC
第一步	2μL Detection buffer稀释的DMSO（1%DMSO）	2μL 4μM ARV-393	2μL 梯度稀释待测样本	15μL 1× Detection buffer（1%DMSO）加5uL 1×Anti-Tag1 Eu dye antibody
	Tag1-DDB1/CRBN protein
	4uL L Tag2- BCL6 protein
	10μL Antibody Mix
第二步	用封板膜封住板孔，室温孵育2h。

3.检测

在兼容TR-FRET的酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。

【结果计算】

1. 计算信号值：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘以10000，即

信号值= (665/620)*10000

2. 根据信号值计算δ值：

δ值= (Std-NC)/NC*100

3.计算CV（%）

CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio×100%

【数据示例】

以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。

ARV-393 ,nM	Ratio	CV(%)	Net Signal
400	1568.00	30%	317.47
200	3186.00	9%	748.24
100	3240.50	2%	762.75
50	1637.50	31%	335.97
25	575.90	11%	53.33
12.5	443.00	7%	17.94
6.25	405.85	1%	8.05
3.125	393.80	5%	4.85
1.5625	390.50	2%	3.97
0.78125	385.65	2%	2.68
0 (DMSO)	375.60	1%	0
Eu only	126.30	5%
S/B	25.66
EC50			71

生物活性

UniOne® TR-FRET Human BCL6/CRBN PROTAC Binding Kit

来源

储存条件

生物活性

UniOne^® TR-FRET Human BCL6/CRBN PROTAC Binding Kit