产品中心药物筛选试剂盒 UniOne®TR-FRET

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UniOne^® TR-FRET Human CD40/CD40L Binding Kit

Datasheet COA

价格￥4,380.00 （供应商现货： 3-5个工作日）

货号 UA086020

规格

100T500T2500T10000T

数量

产品介绍

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背景介绍

试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），用于测定 CD40 与 CD40L 之间的相互作用。该方法可以实现简单快速的高通量鉴定抑制剂和抗体阻断剂。
如图所示，CD40 与 CD40L 之间的相互作用是通过使用 Eu 标记的抗 Tag1 抗体（TR-FRET 供体）和 Accepter 标记的抗 Tag2 抗体（TR-FRET受体）检测的。由于CD40 与 CD40L结合介导供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET），使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。该特定信号与 CD40 与 CD40L 相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。

产品规格

来源

Human
储存条件

将试剂盒保存在-80°C或以下。在适当的储存条件下，试剂保持稳定直到标签上标明的有效期。试剂一旦解冻， CD40和CD40L原液可以再冻融一次；标签抗体溶液可以再冻融一次。为了避免反复冻融，建议将剩余的原液分装到一次性容器中用于-80°C储存。解冻后的稀释液和检测缓冲液可储存在2-8°C。

产品组分

Table 1. Kit Components and Storage Conditions

Component	Concentration	100 TESTS	500 TESTS	2500 TESTS	10000 TESTS	Storage Temp.
Tag1-CD40 protein	100×	4μL	20μL	100μL	400μL	-80°C
Tag2-CD40L protein	100×	4μL	20μL	100μL	400μL	-80°C
Selicrelumab (12.5μM)	100×	3μL	10μL	50μL	200μL	-80°C
Anti-Tag1 Eu dye antibody	50×	10μL	50μL	250μL	1mL	-80°C
Anti-Tag2 Acceptor antibody	12.5×	40μL	200μL	1mL	4mL	-80°C
Detection buffer	10×	400μL	2mL	10mL	40mL	-80°C

操作步骤

1试剂准备

使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。

1.1 缓冲液（1×）配制

2mL Detection buffer（10×）中加入18mLddH₂O，混匀备用

表2. 试剂配置及用量

试剂名称	配置	用量（μL）
Tag1-CD40 protein	取20μL Tag1-CD40 protein原液，1× Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。	4
Tag2- CD40L protein	取20μL Tag2- CD40L protein原液，1×Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。	4
Selicrelumab（12.5μM）或待测药物	按照反应体系，化合物用1×Detection buffer稀释到待测浓度。保证所有检测孔中DMSO的含量一致。	2
Antibody Mix	取50μL Anti-Tag1 Eu dye antibody，用Detection buffer稀释至2500μL，混匀；取200μL Anti-Tag2 accepter antibody，用Detection buffer稀释至2500μL，混匀，1:1混合为Antibody Mix。	10

1.2 待测样品梯度稀释

使用1×Detection buffer进行待测样品和标准品的配制。若样品的储液为DMSO，建议保持体系中DMSO 含量一致，(检测缓冲波中不含DMSO，请根据标准品或待测样品稀释情况向1×Detection buffer中添加DMSO)目最高不超过2%。请根据实验情况配制标准品总量，以下内容仅供参考。

表3. Selicrelumab梯度稀释

	Selicrelumab终浓度（nM）	Selicrelumab配制浓度（nM）	配置方法
①	12.500	125.000	5μL 12.5μM 母液+495μL 1× Detection buffer
②	6.250	62.500	50μL ① +50μL 1× Detection buffer
③	3.125	31.250	50μL ② +50μL 1× Detection buffer
④	1.563	15.625	50μL ③ +50μL 1× Detection buffer
⑤	0.781	7.813	50μL ④ +50μL 1× Detection buffer
⑥	0.391	3.906	50μL ⑤ +50μL 1× Detection buffer
⑦	0.195	1.953	50μL ⑥ +50μL 1× Detection buffer
⑧	0.098	0.977	50μL ⑦ +50μL 1× Detection buffer
⑨	0.049	0.488	50μL ⑧ +50μL 1× Detection buffer
⑩	0.024	0.244	50μL ⑨ +50μL 1× Detection buffer
Blank	0	0	100μL 1× Detection buffer
NC			100μL 1× Detection buffer

2 加样及对照

2.1 实验孔加样顺序：4μL Tag1-CD40 protein，2μL Selicrelumab 或待检测样品，4μL Tag2- CD40L protein，10uL混匀的抗体Mix（Anti-Tag1 Eu dye antibody和Anti-Tag2 accepter antibody 1:1混匀），依次加入384浅孔板中。

2.2 阴性对照孔（Blank）：与待测样本DMSO含量一致的溶液。

2.3 NC：15μL 1× Detection buffer加5μL稀释后的Anti-Tag1 Eu dye antibody。

表4. 加样及对照

	阴性对照	阳性对照	样本	NC
第一步	2μL 1× Detection buffer	2μL 125nM MRT-6160	2μL 梯度稀释待测样本	15μL 1× Detection buffer 加5uL 1×Anti-Tag1 Eu dye antibody
	4μL Tag1-CD40 protein
	4μL Tag2- CD40L
	10μL Antibody Mix
第二步	用封板膜封住板孔，室温孵育2h。

*阴性对照和质控，推荐使用与待测样品基质相同的溶液替代1×Detection buffer。

*所有检测孔中DMSO或其他基质保持一致。

3.检测

在兼容TR-FRET的酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。

【结果计算】

1. 计算信号值：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘以10000，即

信号值= (665/620)*10000

2. 根据信号值计算δ值：

δ值= (Std-NC)/NC*100

3.计算CV（%）

CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio×100%

【数据示例】

以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。

CD40L,nM	Ratio	CV (%)	δ值
25	256.2	3.9%	619.9
12.5	231.2	2.8%	549.6
6.25	135.5	4.0%	280.6
3.13	88.3	1.2%	148.2
1.56	61.9	0.0%	74.1
0.78	49.1	2.5%	37.8
0.39	39.7	1.2%	11.5
0.20	37.0	1.5%	4.0
0.10	36.6	0.0%	3.0
Buffer Blank	35.6	0.2%
Eu only	33.5	4.4%

生物活性

UniOne® TR-FRET Human CD40/CD40L Binding Kit

来源

储存条件

生物活性

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