产品中心药物筛选试剂盒 UniOne®TR-FRET

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UniOne^® TR-FRET Human BCL-XL/VHL PROTAC Binding Kit

Datasheet COA

价格￥13,080.00 （ 1-2周）

货号 UA086019

规格

500T2500T10000T

数量

产品介绍

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背景介绍

试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），用于测定分子胶 BCL-XL DEGRADER-2 及待检测化合物介导的 VHL 与 BCL-XL 相互作用。该方法是实现简单快速的检测能够介导 VHL 与 BCL-XL 相互作用的小分子的高通量形式。
如所示，VHL 和 BCL-XL 之间的相互作用是通过使用Eu标记的抗Tag1抗体（TR-FRET 供体）和 Accepter 标记的抗 Tag2 抗体（TR-FRET受体）检测的。由于分子胶 BCL-XL DEGRADER-2 介导了 VHL 与 BCL-XL 的相互作用，供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET），使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。该特定信号与 BCL-XL DEGRADER-2 和 VHL、BCL-XL 的相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。

产品规格

来源

Human
储存条件

-80℃

产品组分

Table 1. Reagents and Storage Conditions

Component	Concentration	100TESTS	500TESTS	2500TESTS	10000TESTS	Storage Temp.
Tag1-VHL protein	50×	10μL	40μL	200μL	800μL	-80°C
Tag2- BCL-XL protein	50×	10μL	40μL	200μL	800μL	-80°C
BCL-XL DEGRADER-2	0.3 mM	5μL	20μL	50μL	200μL	-80°C
Anti-Tag1 Eu dye antibody	50×	10μL	50μL	250μL	1000μL	-80°C
Anti-Tag2 AC antibody	100×	5μL	25μL	125μL	500μL	-80°C
Detection buffer	10×	400μL	2 mL	10 mL	40 mL	-80°C

*Reagents should be avoided from repeated freeze-thaw cycles. Aliquot upon first thaw and store under recommended conditions. Valid for one year.

操作步骤

1试剂准备

使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20uL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。

1.1 缓冲液（1×）配制

2mL Detection buffer （10×）中加入18mL无菌水，混匀备用

表2. 试剂配置及用量

试剂名称	配置	用量（μL）
Tag1-VHL protein	取40μL Tag1-VHL protein原液，1× Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。	4
Tag2- BCL-XL protein	取40μL Tag2- BCL-XL protein原液，1×Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。	4
BCL-XL DEGRADER-2	按照反应体系，化合物用1×Detection buffer稀释到待测浓度。保证所有检测孔中DMSO的含量一致。	2
Antibody Mix	取50μL Anti-Tag1 Eu antibody 原液，加入 1×Detection buffer 2.45mL, 混匀；取25μL Anti-Tag2 Ac antibody 原液，加入 1× Detection buffer 2.475mL, 混匀，1:1混合为Antibody Mix。	10

1.2 待测标准品2倍梯度稀释

以BCL-XL DEGRADER-2为例，稀释液为1×Detection buffer，为降低基质效应干扰，推荐使用与待测样品基质相同的溶液稀释；且待测样本根据实际浓度调整。

表3. 样品梯度稀释

	BCL-XL DEGRADER-2终浓度（nM）	BCL-XL DEGRADER-2配制浓度（nM）	配置方法
①	300	3000	2μL 0.3mM 母液+198μL 1× Detection buffer
②	150	1500	50μL ① +50μL 1× Detection buffer
③	75	750	50μL ② +50μL 1× Detection buffer
④	37.5	375	50μL ③ +50μL 1× Detection buffer
⑤	18.75	187.5	50μL ④ +50μL 1× Detection buffer
⑥	9.38	93.75	50μL ⑤ +50μL 1× Detection buffer
⑦	4.69	46.88	50μL ⑥ +50μL 1× Detection buffer
⑧	2.34	23.44	50μL ⑦ +50μL 1× Detection buffer
⑨	1.17	11.72	50μL ⑧ +50μL 1× Detection buffer
⑩	0.59	5.86	50μL ⑨ +50μL 1× Detection buffer
Blank	0	0	100μL 1× Detection buffer

2 加样及对照

2.1 实验孔加样顺序：4μL Tag1-VHL protein，4μL Tag2- BCL-XL protein，2μL BCL-XL DEGRADER-2 或待检测样本，10μL混匀的Antibody Mix，依次加入384浅孔板中。

2.2 阴性对照孔（Blank）：BCL-XL DEGRADER-2 或待检测化合物替换为2uL相同百分含量的DMSO溶液。

2.3 质控孔：15uL Detection buffer加5uL稀释后的Anti-Tag1 Eu dye antibody。

表4. 加样及对照

	阴性对照	阳性对照	样本	NC
第一步	2μL 1× Detection buffer稀释的DMSO	2μL 3μM BCL-XL DEGRADER-2	2μL 梯度稀释待测样本	15μL 1× Detection buffer 加5μL 1×Anti-Tag1 Eu dye antibody
	4μL Tag1-VHL protein
	4μL Tag2- BCL-XL protein
第二步	10μL Antibody Mix
	用封板膜封住板孔，室温孵育1-2小时；

*阴性对照和NC，推荐使用与待测样品基质相同的溶液替代1×Detection buffer。

3.检测

在兼容TR-FRET的酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。

【结果计算】

1. 计算信号值：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘以10000，即

信号值= (665/620)*10000

2. 根据信号值计算Net Signal值：

Net Signal值= (Std-NC)/NC*100

3.计算CV（%）

CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio×100%

【数据示例】

以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。

BCL-XL DEGRADER-2,nM	Ratio	CV	Net Signal
300	247.9	3.0%	881.59
150	247.2	1.5%	878.82
75	193.6	6.1%	666.58
37.5	119.34	16.5%	372.54
18.75	67.44	16.6%	167.04
9.38	49.29	12.1%	95.17
4.69	41.885	2.7%	65.85
2.34	42.345	0.6%	67.67
1.17	39.86	3.6%	57.83
0 (DMSO)	40.085	0.4%	58.72
Eu only	25.255	7.0%

生物活性

UniOne® TR-FRET Human BCL-XL/VHL PROTAC Binding Kit

来源

储存条件

生物活性

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