产品中心药物筛选试剂盒 UniOne®TR-FRET

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UniOne^® TR-FRET Human BRD4（BD1+BD2）/H4 Binding Kit

Datasheet COA

价格￥13,080.00 （供应商现货： 3-5个工作日）

货号 UA086018

规格

500T2500T10000T

数量

产品介绍

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背景介绍

试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），用于测定 BRD4 与[LYS(5,8,12,16)AC] H4(1-21) peptide 之间的相互作用。该方法可以实现简单快速的高通量鉴定抑制剂和抗体阻断剂。
如图所示，BRD4 与 [LYS(5,8,12,16)AC] H4(1-21) peptide 之间的相互作用是通过使用 Eu 标记的抗 Tag1 抗体（TR-FRET 供体）和 Accepter 标记的抗 Tag2 抗体（TR-FRET受体）检测的。由于BRD4 与 [LYS(5,8,12,16)AC] H4(1-21) peptide 结合介导供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET），使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。该特定信号与 BRD4 与 [LYS(5,8,12,16)AC] H4(1-21) peptide 相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。

产品规格

来源

Human
储存条件

-80℃

产品组分

Table 1. Kit Components and Storage Conditions

Component	Concentration	100 TESTS	500 TESTS	2500 TESTS	10000 TESTS	Storage Temp.
(+)-JQ-1	300μM	3μL	10μL	50μL	200μL	-80℃
Tag1-BRD4 protein	100×	4μL	20μL	100μL	400μL	-80℃
Tag2- peptide	100×	4μL	20μL	100μL	400μL	-80℃
Anti-Tag1 Eu dye antibody	50×	10μL	50μL	250μL	1000μL	-80℃
Anti-Tag2 Ac antibody	12.5×	40μL	200μL	1000μL	4000μL	-80℃
Detection buffer	10×	400μL	2mL	10mL	40mL	-80℃

* Avoid repeated freeze-thaw cycles of reagents. Aliquot upon first thaw and store according to the specified conditions. Shelf life is one year.

操作步骤

1试剂准备

使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20uL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。

1.1 缓冲液（1×）配制

2mL Detection buffer （10×）中加入1.8mL无菌水，混匀备用

表2. 试剂配置及用量

试剂名称	配置	用量（μL）
Tag1-BRD4 protein	取20μL Tag1-BRD4 protein原液，1× Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。	4
Tag2- peptide protein	取20μL Tag2-peptide protein原液，1×Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。	4
(+)-JQ-1	按照反应体系，化合物用1×Detection buffer稀释到待测浓度。保证所有检测孔中DMSO的含量一致。	2
Antibody Mix	取50μL Anti-Tag1 Eu dye antibody，用Detection buffer稀释至2500μL，混匀；取200μL Anti-Tag2 Ac antibody，用1×Detection buffer稀释至2500μL，混匀，1:1混合为Antibody Mix。	10

1.3 待测样品或标准品梯度稀释

以(+)-JQ-1（JQ-1）为例，稀释液为1× Detection buffer，为降低基质效应干扰，推荐使用与待测样品基质相同的溶液稀释；且待测样本根据实际浓度调整。

表3. 样品梯度稀释

	(+)-JQ-1终浓度（nM）	(+)-JQ-1配制浓度（nM）	配置方法
①	300	3000	1μL 300μM 母液+99μL 1× Detection buffer
②	100	1000	50μL ① +150μL 1× Detection buffer (1%DMSO)
③	50	500	50μL ② +50μL 1× Detection buffer (1%DMSO)
④	25	250	50μL ③ +50μL 1× Detection buffer (1%DMSO)
⑤	12.5	125	50μL ④ +50μL 1× Detection buffer (1%DMSO)
⑥	6.25	62.5	50μL ⑤ +50μL 1× Detection buffer (1%DMSO)
⑦	3.125	31.25	50μL ⑥ +50μL 1× Detection buffer (1%DMSO)
⑧	1.5625	15.625	50μL ⑦ +50μL 1× Detection buffer (1%DMSO)
⑨	0.78125	7.8125	50μL ⑧ +50μL 1× Detection buffer (1%DMSO)
⑩	0.390625	3.90625	50μL ⑨ +50μL 1× Detection buffer (1%DMSO)
Blank	0	0	100μL 1× Detection buffer (1%DMSO)

2 加样及对照

2.1 实验孔加样顺序：4μL Tag1-BRD4 protein，4μL Tag2- peptide protein，2μLJQ-1 或待检测样品，10uL混匀的Antibody Mix，依次加入384浅孔板中。

2.2 最大值对照孔（Blank）： 4μL Tag1-BRD4 protein，4μL Tag2- peptide protein，2μL含1%DMSO的1×Detection Buffer，10uL混匀的Antibody Mix，依次加入384浅孔板中。

2.3 最小值对照孔：4μL Tag1-BRD4 protein，4μL Tag2- peptide protein，2μL3000nM JQ-1，10uL混匀的Antibody Mix，依次加入384浅孔板中。

2.4 质控孔：15uL 1×缓冲液加5μL稀释后的Anti-Tag1 Eu Antibody Mix。

表4. 加样及对照

	最大值对照	最小值对照	样本	NC
第一步	2μL 1× Detection buffer稀释的DMSO	2μL 3000nM JQ-1	2μL 梯度稀释待测样本	15uL 1× Detection buffer 加5uL 1×Anti-Tag1 Eu dye antibody
	4μL Tag1-BRD4 protein
	4μL Tag2- peptide protein
	室温孵育10 min
第二步	10μL Mix-1
	用封板膜封住板孔，室温孵育1-2h；

*对照和NC，推荐使用与待测样品基质相同的溶液替代1×Detection buffer。

3.检测

在兼容TR-FRET的酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。

【结果计算】

1. 计算信号值：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘以10000，即

信号值= (665/620)*10000

2. 根据信号值计算δ值：

δ值= (Std-NC)/NC*100

3.计算CV（%）

CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio×100%

【数据示例】

以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。

JQ1,nM	Ratio	CV(%)	Net Signal
300	30.625	2%	26.20
100	33.885	4%	39.78
50	79.755	35%	230.87
25	86.945	5%	258.72
12.5	99.61	3%	310.87
6.25	102.1	3%	321.10
3.125	103.9	0%	328.27
1.5625	101.15	1%	316.90
0.78125	104.65	2%	331.58
0.390625	107.85	2%	344.40
0	102.79	8%	323.08
Eu only	24.275	4%	0
S/B	3.36
IC50			41.83

生物活性

UniOne® TR-FRET Human BRD4（BD1+BD2）/H4 Binding Kit

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