UniOne^® TR-FRET Human BRD4/CRBN PROTAC Binding Kit

价格￥4,380.00 （供应商现货： 3-5个工作日）

货号 UA086009

规格

100T500T2500T10000T

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背景介绍

试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），用于测定分子胶 BET Degrader-1及待检测化合物介导的 DDB1/CRBN 复合体与 BRD4 相互作用。BRD4 包含溴结构域 1 和 2 （bromodomain 1 and 2）.该方法是实现简单快速的检测能够介导 DDB1/CRBN 复合体与 BRD4 相互作用的小分子的高通量形式。
如所示，DDB1/CRBN 和 BRD4 之间的相互作用是通过使用Eu标记的抗Tag1抗体（TR-FRET 供体）和 Accepter 标记的抗 Tag2 抗体（TR-FRET受体）检测的。由于分子胶 BET Degrader-1介导了 DDB1/CRBN 与 BRD4 的相互作用，供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET），使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。该特定信号与 BET Degrader-1 和 DDB1/CRBN、BRD4 的相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。

产品规格

产品组分

Component	Concentration	500 TESTS	2500 TESTS	10000 TESTS	Storage Temp.
Tag1-DDB1/CRBN protein	25×	80μL	400μL	1600μL	-80°C
Tag2-BRD4 protein	100×	20μL	100μL	400μL	-80°C
BET Degrader-1 (100μM)	10μM	10μL	50μL	200μL	-80°C
Anti-Tag1 Eu dye antibody	50×	50μL	250μL	1000μL	-80°C
Anti-Tag2 Ac antibody	12.5×	200μL	1000μL	4000μL	-80°C
Detection buffer	10×	2mL	10mL	40mL	-80°C

*Repeated freeze-thaw cycles should be avoided. Aliquot upon first thaw and store according to the specified conditions. Valid for one year.

操作步骤

1试剂准备

使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20uL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。

1.1 缓冲液（1×）配制

2mL Detection buffer （10×）中加入18mL无菌水，混匀备用

表2. 试剂配置及用量

试剂名称	配置	用量（μL）
BET Degrader-1	按照反应体系，化合物用1×Detection buffer稀释到待测浓度。保证所有检测孔中DMSO的含量一致。	2
Tag1-DDB1/CRBN protein	取80μL Tag1-DDB1/CRBN protein原液，1× Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。	4
Tag2- BRD4 protein	取20μL Tag2- BRD4 protein原液，1×Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。	4
Anti-Tag1 Eu dye antibody	取50μL Anti-Tag1 Eu dye antibody 原液，加入 1×Detection buffer 2.45mL, 混匀备用。	5
Anti-Tag2 Ac antibody	取200μL Anti-Tag2 Ac antibody 原液，加入 1× Detection buffer 2.3mL, 混匀备用。	5

1.2 Mix-1配制

Anti-Tag1 Eu dye antibody和Anti-Tag2 Ac antibody分别稀释后1:1混匀备用

1.3 样品2倍梯度稀释

以BET Degrader-1为例，稀释液为1× Detection buffer，为降低基质效应干扰，推荐使用与待测样品基质相同的溶液稀释；且待测样本根据实际浓度调整。

表3. 样品梯度稀释

2. 加样及对照

2.1 实验孔加样顺序：4uL Tag1-DDB1/CRBN protein，4μL Tag2- BRD4 protein，2μL BET Degrader-1或待检测样品，10μL混匀的Mix-1，依次加入384浅孔板中。

2.2 阴性对照孔（Blank）： BET Degrader-1或待检测化合物替换为2μL相同百分含量的DMSO溶液。

2.3 NC：16uL 1×缓冲液加4μL稀释后的Anti-Tag1 Eu dye antibody。

表4. 加样及对照

	阴性对照	阳性对照	样本	NC
第一步	2μL 1× Detection buffer	2μL 100nM BET Degrader-1	2μL 梯度稀释待测样本	15uL 1× Detection buffer 加5uL 1×Anti-Tag1 Eu dye antibody
	4μL Tag1-DDB1/CRBN protein
	4μL Tag2- BRD4 protein
	室温孵育10 min
第二步	10μL Mix-1
	用封板膜封住板孔，室温孵育2h；