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试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），用于测定分子胶 CC-885 及待检测化合物介导的 GSPT1 与 CRBN 相互作用。该方法是实现简单快速的检测能够介导 GSPT1 与 CRBN 相互作用的小分子的高通量形式。
如所示，GSPT1 和 CRBN 之间的相互作用是通过使用Eu标记的抗Tag1抗体（TR-FRET 供体）和 Ac 标记的抗 Tag2 抗体（TR-FRET受体）检测的。由于分子胶 CC-885 介导了 GSPT1 与 CRBN 的相互作用，供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET），使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。该特定信号与 CC-885 和 GSPT1、CRBN 的相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤
来源
Human储存条件
-80℃
Component
Concentration
100 TESTS
500 TESTS
2500 TESTS
10000 TESTS
Storage
Tag1-DDB1/CRBN protein
200×
2.5μL
13μL
63μL
250μL
-80℃
Tag2- GSPT1 protein
200×
2.5μL
13μL
63μL
250μL
-80℃
CC-885 (4mM)
100×
3μL
5μL
25μL
100μL
-80℃
Anti-Tag1 Eu dye
antibody
100×
5μL
25μL
125μL
500μL
-80℃
Anti-Tag2 Ac antibody
100×
5μL
25μL
125μL
500μL
-80℃
Detection buffer
1×
2ml
10mL
50mL
200mL
4℃
*Avoid repeated freeze-thaw cycles of reagents. Recommend aliquoting after first thaw and storing according to conditions specified for a shelf life of one year.
1试剂准备
使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。
1.1 缓冲液（1×）
表2. 试剂配置及用量
试剂名称
配置
用量（μL）
CC-885
按照反应体系，化合物用1×Detection buffer稀释到待测浓度。 2
Tag1-DDB1/CRBN protein
取40μL Tag1-DDB1/CRBN protein原液，1× Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。 4
Tag2- GSPT1 protein
取40μL Tag2- GSPT1 protein原液，1×Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。 4
Antibody Mix
取12.5μL Anti-Tag1 Eu dye antibody 原液，加入 1×Detection buffer 至2.5mL, 混匀；
取12.5μL Anti-Tag2 Ac antibody 原液，加入 1× Detection buffer 至2.5mL, 混匀，1:1混合为Antibody Mix。
10
1.2 待测样品梯度稀释
以CC-885为例，稀释液为1× Detection buffer，为降低基质效应干扰，推荐使用与待测样品基质相同的溶液稀释；且待测样本根据实际浓度调整。
表3. 样品梯度稀释
CC-885终浓度（nM）
CC-885配制浓度（nM）
配置方法
4000.00
40000.00
2μL 4mM 母液+198μL 1× Detection buffer
1333.33
13333.33
50μL ① + 100μL 1× Detection buffer
444.44
4444.44
50μL ② + 100μL 1× Detection buffer
148.15
1481.48
50μL ③ + 100μL 1× Detection buffer
49.38
493.83
50μL ④ + 100μL 1× Detection buffer
16.46
164.61
50μL ⑤ + 100μL 1× Detection buffer
5.49
54.87
50μL ⑥ + 100μL 1× Detection buffer
1.83
18.29
50μL ⑦ + 100μL 1× Detection buffer
0.61
6.10
50μL ⑧ + 100μL 1× Detection buffer
Blank
0
0
100μL 1× Detection buffer
2 加样及对照
2.1 实验孔加样顺序：4μL Tag1-DDB1/CRBN protein工作液，2μL待测样本，再加入4μL Tag2- GSPT1 protein工作液，10μL混匀的Antibody Mix，依次加入384浅孔板中。
2.2 最低值对照孔：2μL 1× Detection buffer代替所检测样本；
2.3 最高值对照孔：2μL 40000nM CC-885代替所检测样本；
2.4 NC(Eu only)：16μL 1× Detection buffer加4μL稀释后的Anti-Tag1 Eu dye antibody。
表4. 加样及对照
最低值对照孔
最高值对照孔
样本
NC
第一步
2μL
1× Detection buffer
2μL
4000nM CC-885
2μL
梯度稀释待测样本
15μL 1× Detection buffer
加5μL 1×Anti-Tag1 Eu dye antibody
4μL Tag1-DDB1/CRBN protein
第二步
4μL Tag2- GSPT1 protein
10μL Antibody Mix
用封板膜封住板孔，室温孵育2小时；
*阴性对照和NC，推荐使用与待测样品基质相同的溶液替代1×Detection buffer。
3.检测
在兼容TR-FRET的酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。
【结果计算】
1. 计算信号值：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘以10000，即
信号值= (665/620)*10000
2. 根据信号值计算Net Signal：
Net Signal = (Std-NC)/NC*100
3.计算CV（%）
CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio×100%
【数据示例】
以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。
CC-885 nM Average CV Average 4000 3553.5 1% 1172.97 2000 3292 9% 1079.29 1000 3113.5 2% 1015.35 500 2863 8% 925.61 250 2506 1% 797.73 125 2331 3% 735.03 62.5 1971 0% 606.07 31.25 1757.5 9% 529.59 15.625 1402 8% 402.24 7.8125 1042.85 9% 273.58 3.90625 825.35 12% 195.67 0 374.15 14% 25.08 Eu+AC 279.15 4% S/B 9.50
生物活性
标准曲线
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