产品中心药物筛选试剂盒 UniOne®TR-FRET

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UniOne^® TR-FRET Human RAK4/CRBN PROTAC Binding KIT

Datasheet COA

价格￥13,080.00 （ 1-2周）

货号 UA086005

规格

500T2500T10000T

数量

产品介绍

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背景介绍

试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），用于测定分子胶 PROTAC IRAK4 DEGRADER-1 及待检测化合物介导的 IRAK4 与 CRBN 相互作用。该方法是实现简单快速的检测能够介导 IRAK4 与 CRBN 相互作用的小分子的高通量形式。
如所示，IRAK4 和 CRBN 之间的相互作用是通过使用Eu标记的抗Tag1抗体（TR-FRET 供体）和 Ac 标记的抗 Tag2 抗体（TR-FRET受体）检测的。由于分子胶 PROTAC IRAK4 DEGRADER-1 介导了 IRAK4 与 CRBN 的相互作用，供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET），使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。该特定信号与 PROTAC IRAK4 DEGRADER-1 和 IRAK4、CRBN 的相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤
图1. IRAK4 & CRBN TR-FRET检测原理

产品规格

来源

Human
储存条件

-80℃

产品组分

Component	Concentration	100 TESTS	500 TESTS	2500 TESTS	10000 TESTS	Storage
Tag1-IRAK4 protein	50×	8 μL	40 μL	200 μL	800 μL	-80°C
Tag2-DDB1/CRBN protein	50×	8 μL	40 μL	200 μL	800 μL	-80°C
PROTAC IRAK4 degrader-1	100×	3 μL	5 μL	25 μL	125 μL	-80°C
Anti-Tag1 Eu dye antibody	50×	10 μL	50 μL	250 μL	1000 μL	-80°C
Anti-Tag2 Ac antibody	12.5×	40 μL	200 μL	1000 μL	5000 μL	-80°C
Detection buffer	10×	1 mL	2 mL	6 mL	25 mL	-80°C

*Avoid repeated freeze-thaw cycles of reagents. Recommend aliquoting after first thaw and storing according to conditions specified for a shelf life of one year.

操作步骤

1试剂准备

使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。

1.1 缓冲液（1×）

2mL Detection buffer （10×）中加入18mL无菌水，混匀备用

表2. 试剂配置及用量

试剂名称	配置	用量（μL）
PROTAC IRAK4 DEGRADER-1	按照反应体系，化合物用1×Detection buffer稀释到待测浓度。	2
Tag1-IRAK4 protein	取40μL Tag1-IRAK4 protein原液，1× Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。	4
Tag2-DDB1/CRBN protein	取40μL Tag2-DDB1/CRBN protein原液，1×Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。	4
Antibody Mix	取50μL Anti-Tag1 Eu dye antibody 原液，加入 1×Detection buffer 至2.5mL, 混匀；取200μL Anti-Tag2 Ac antibody 原液，加入 1× Detection buffer 至2.5mL, 混匀，1:1混合为Antibody Mix。	10

1.2 待测样品梯度稀释

以PROTAC IRAK4 DEGRADER-1为例，稀释液为1× Detection buffer，为降低基质效应干扰，推荐使用与待测样品基质相同的溶液稀释；且待测样本根据实际浓度调整。

表3. 样品梯度稀释

	PROTAC IRAK4 DEGRADER-1终浓度（nM）	PROTAC IRAK4 DEGRADER-1配制浓度（nM）	配置方法
	150	1500	2μL 150μM 母液+198μL 1× Detection buffer
	75	750	50μL ① + 50μL 1× Detection buffer
	37.5	375	50μL ② + 50μL 1× Detection buffer
	18.75	187.5	50μL ③ + 50μL 1× Detection buffer
	9.38	93.75	50μL ④ + 50μL 1× Detection buffer
	4.69	46.88	50μL ⑤ + 50μL 1× Detection buffer
	2.34	23.44	50μL ⑥ + 50μL 1× Detection buffer
	1.17	11.72	50μL ⑦ + 50μL 1× Detection buffer
	0.59	5.86	50μL ⑧ + 50μL 1× Detection buffer
Blank	0	0	100μL 1× Detection buffer

2 加样及对照

2.1 实验孔加样顺序：4μL Tag1-IRAK4 protein工作液，2μL待测样本，再加入4μL Tag2-DDB1/CRBN protein 工作液，10μL混匀的Antibody Mix，依次加入384浅孔板中。

2.2 最低值对照孔：2μL 1× Detection buffer代替所检测样本；

2.3 最高值对照孔：2μL 40000nM PROTAC IRAK4 DEGRADER-1代替所检测样本；

2.4 NC(Eu only)：16μL 1× Detection buffer加4μL稀释后的Anti-Tag1 Eu dye antibody。

表4. 加样及对照

	最低值对照孔	最高值对照孔	样本	NC
第一步	2μL 1× Detection buffer	2μL 1500nM PROTAC IRAK4 DEGRADER-1	2μL 梯度稀释待测样本	15μL 1× Detection buffer 加5μL 1×Anti-Tag1 Eu dye antibody
	4μL Tag1-IRAK4 protein
第二步	4μL Tag2-DDB1/CRBN protein
	10μL Antibody Mix
	用封板膜封住板孔，室温孵育2小时；

*阴性对照和NC，推荐使用与待测样品基质相同的溶液替代1×Detection buffer。

3.检测

在兼容TR-FRET的酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。

【结果计算】

1. 计算信号值：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘以10000，即

信号值= (665/620)*10000

2. 根据信号值计算Net Signal：

Net Signal = (Std-NC)/NC*100

3.计算CV（%）

CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio×100%

【数据示例】

以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。

PROTAC IRAK4 degrader-1 nM	Average	CV	Average
125	231.3	5.0%	621.35
62.5	225.4	5.7%	602.95
31.25	169.4	2.7%	428.30
15.625	102.335	5.2%	219.15
7.8125	63.97	0.4%	99.50
3.90625	50.34	11.3%	56.99
0 (DMSO)	38.455	4.1%	19.93
Eu +AC	32.155	2.9%	0.28
S/B	6.01
IC50			23.96

生物活性
- 标准曲线

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