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试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），用于测定分子胶 AK-1690 及待检测化合物介导的 STAT6 与 CRBN 相互作用。该方法是实现简单快速的检测能够介导 STAT6 与 CRBN 相互作用的小分子的高通量形式。
如所示，STAT6 和 CRBN 之间的相互作用是通过使用Eu标记的抗Tag1抗体（TR-FRET 供体）和 Ac 标记的抗 Tag2 抗体（TR-FRET受体）检测的。由于分子胶 AK-1690 介导了STAT6 与 CRBN 的相互作用，供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET），使受体抗体特异性发射665nm波长信号。该特定信号与 AK-1690 和 STAT6、CRBN 的相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。
来源
Human储存条件
-80℃
组分
浓度
100T
500T
2500T
10000T
储存温度
Tag1-STAT6 protein
50×
10μL
40μL
200μL
800μL
-80℃
Tag2- CRBN protein
50×
10μL
40μL
200μL
800μL
-80℃
AK-1690 (150μM)
100×
5μL
10μL
50μL
200μL
-80℃
Anti-Tag1 Eu antibody
50×
10μL
50μL
250μL
1000μL
-80℃
Anti-Tag2 Ac antibody
12.5×
40μL
200μL
1000μL
4000μL
-80℃
Detection buffer
10×
400μL
2mL
10mL
40mL
-80℃
1、试剂准备
1.1 使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。
表1. 试剂配制
试剂名称
配置
每个检测孔用量μL
Detection buffer 1
取2mL 10 × Detection buffer1加入18mL去离子水，稀释至1×，混匀备用。
-
AK-1690
按照反应体系，化合物用1×Detection buffer稀释到待测浓度。
保证所有检测孔中DMSO的含量一致。
2
Tag1-STAT6 protein
取40μL Tag1-STAT6 protein原液，1× Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。
4
Tag2- CRBN protein
取40μL Tag2-CRBN protein原液，1×Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。
4
Antibody Mix
取50μL Anti-Tag1 Eu antibody 原液，加入 1×Detection buffer 2.45mL, 混匀；取200μL Anti-Tag2 Ac antibody 原液，加入 1× Detection buffer 2.3mL, 混匀；二者1:1混合为Antibody Mix。
10
1.2 待测样品梯度稀释
以AK-1690为例，稀释液为1× Detection buffer，为降低基质效应干扰的影响，推荐使用与待测样品基质相同的溶液稀释；且待测样本根据实际浓度调整。
表2. AK-1690梯度稀释（根据实际情况调整）
AK-1690终浓度（nM）
AK-1690配制浓度（nM）
配置方法
①
150
1500
1μL 150μM AK-1690 +99μL 1× Detection buffer
②
100
1000
30μL ① +15μL 1× Detection buffer
③
66.67
666.67
30μL ② +15μL 1× Detection buffer
④
44.44
444.44
30μL ③ +15μL 1× Detection buffer
⑤
29.63
296.30
30μL ④ +15μL 1× Detection buffer
⑥
19.75
197.53
30μL ⑤ +15μL 1× Detection buffer
⑦
13.17
131.69
30μL ⑥ +15μL 1× Detection buffer
⑧
8.78
87.79
30μL ⑦+15μL 1× Detection buffer
⑨
5.85
58.53
30μL ⑧+15μL 1× Detection buffer
Blank
0
0
30μL 1× Detection buffer
2、加样及对照
2.1 待测样本：2μL梯度稀释待测样本，4μL Tag1-STAT6 protein工作液，4μL Tag2-CRBN protein工作液，10μL混匀的Antibody Mix（Tag2-CRBN protein可与Antibody Mix按比例混合后加入），依次加入384浅孔板中。
2.2 阳性药标曲：2μL 梯度稀释AK-1690，4μL Tag1-STAT6 protein工作液，4μL Tag2-CRBN protein工作液，10μL Antibody Mix。
阳性药标曲
待测样本
空白对照孔
NC
第一步
2μL
梯度稀释AK-1690
2μL
梯度稀释待测样本
2μL
1× Detection buffer
10μL 1× Detection buffer
加10μL Antibody Mix
4μL Tag1- STAT6 protein
第二步
4μL Tag2-CRBN protein
10μL Antibody Mix
用封板膜封住板孔，室温孵育2小时；
2.3 空白对照孔：2μL 1× Detection buffer代替待测样本；
2.4 NC：10μL 1× Detection buffer加10μL Antibody Mix。
所有样本加完后，离心，盖封板膜，室温孵育2小时。
3、检测
在兼容TR-FRET的酶标仪上检测。激发光为320/340nm，检测620nm和665nm的发射波长。
【结果计算】
1) 计算信号值（Ratio）：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘10000。
Ratio = (665/620) ×10000
2) 根据信号值计算Net signal：
Net signal = (Std-NC)/NC×100
3) 计算CV（%）：
CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio × 100%
【数据示例】
以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因读板仪器而异。
注：推荐微孔板（384孔板，白色，浅孔）
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