Baculovirus Immunostaining Rapid Titration Kit

1、试剂准备：

1)4%多聚甲醛溶液：称取4g多聚甲醛于玻璃烧杯中，加入50mL蒸馏水中，在通风橱内用磁力搅拌器将温度升至60℃（不超过65℃），边搅拌边加入30~50 μL的4N氢氧化钠以中和溶液，用pH试纸检测所得pH值，最终pH值应为pH 6~8，待溶液冷却，加入50mL 0.2M磷酸钠溶液(pH 7.4)稀释，最终pH值应为7~8，必要时调整。使用0.45μm滤膜过滤，分装后储存于–20℃，使用前从–20℃取出并恢复至室温

2)PBST溶液: 称取Na2HPO4 1.42g，KH2PO4 0.24g，KCl 0.2g，NaCl 8g至烧杯中，加入800mL超纯水，待全部溶解后，加入0.5 mL Tween 20，搅拌均匀，用超纯水定容至1L

3)1×山羊血清：将10×山羊血清用PBST溶液稀释10倍

4)1×小鼠GP64抗体：将1000×小鼠GP64抗体用1×山羊血清稀释1000倍

5)1×山羊抗小鼠抗体-HRP：将1000×山羊抗小鼠抗体-HRP用1×山羊血清稀释1000倍

2、杆状病毒感染：

1)在96孔细胞培养板的一行（12孔）接种处于对数生长期早期的Sf9细胞（每孔6.5~7×10⁴个细胞）

2)培养板于28℃孵育 >2hr或孵育过夜

3)取50μL病毒样品用培养基作为稀释液制备病毒梯度稀释样品。稀释范围根据需要调整，各稀释梯度间充分混匀。本说明以病毒样品稀释度分别为10⁴、10⁵和10⁶为例，该稀释范围适用于滴度为2×10⁶至1×10⁹ IFU/mL的病毒样品

4)小心吸出培养基，注意避免刮擦孔底细胞

5)向相应孔中加入25μL病毒稀释样品（10⁴稀释样品取3孔，10⁵和10⁶稀释样品各取4孔），阴性对照孔加入25μL培养基，轻振培养板使病毒均匀分布

6)将培养板用封口膜封口，28℃孵育1hr

7)提前15min将10×覆盖层与Sf9细胞完全培养基于37℃水浴预热

8)吸出接种物，避免刮取孔底细胞，将10×覆盖层用Sf9细胞完全培养基稀释成1×覆盖层，每孔加入50 μL的1×覆盖层，用封口膜封口，于28℃孵育43-48hr

3、杆状病毒滴度检测：

1)将150μL的4%多聚甲醛（需提前恢复至室温）小心加入含覆盖层的各孔中，室温孵育30min

2)弃去孔中液体，将96孔板在纸巾上轻拍，每孔加入200μL PBST溶液，洗涤3~4次，每次在振荡器上低速振板孵育5min

3)每孔加入50μL的1×山羊血清，室温，振荡器上低速振板孵育20min

4)弃去孔中液体，将96孔板在纸巾上轻拍，无需洗涤，每孔加入25μL 1×小鼠GP64抗体，37℃孵育25min

5)弃去孔中液体，将96孔板在纸巾上轻拍，每孔加入200μL PBST溶液，洗涤2次，每次在振荡器上低速振板孵育5min

6)每孔加入50μL 1×山羊抗小鼠抗体-HRP，37℃孵育25min

7)弃去孔中液体，将96孔板在纸巾上轻拍，每孔加入200μL PBST溶液，洗涤3次，每次在振荡器上低速振板孵育5min

8)每孔加入50μL显色底物（需提前恢复至室温），在室温下孵育1.5-3hr。加入显色底物后最快10min即可获得病毒滴度的初步结果，但准确性较低

9)显微镜下对各孔感染灶（蓝紫色细胞团）进行计数

10)以含5~25个感染灶的稀释度为准计算病毒滴度：病毒滴度（IFU/mL）=每孔平均病灶数×稀释倍数×40