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产品中心 其他检测试剂盒 荧光素酶检测试剂盒

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UA-Glo® GTPase Activity Detection Kit

价格 ￥3,200.00 （ 1-2周）
货号 UA079051
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产品介绍

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背景介绍

  • GTPases 为GTP水解酶，是许多细胞信号传导通路的重要组成部分。GTPases对GTP和GDP均具有高亲和力，其和GTP结合后成为活性构型，而当其水解结合的GTP为GDP后则转换为失活构型。GTPases通过两种构型的转变控制许多细胞信号传导通路的激活和关闭。GTPases通过两类蛋白调节其构型的转换：GTPase激活蛋白(GAP)和鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)。其中GAP增强GTPase水解GTP的活性因此关闭信号传导通路，而GEF可以促进GTP取代与失活GTPase结合的GDP，使GTPase恢复活性而激活信号传导。

    UA-Glo® GTPase检测试剂盒可以检测GTPase的活性和其相关的GAP和GEF对GTPase活性的作用。GTPase反应会消耗GTP，剩余的GTP可以通过试剂盒中的G2A试剂将ADP转化为ATP，最后加入的ATP检测试剂含有荧光素酶可以催化ATP和荧光素反应而发光，发光强度和ATP呈正比，也即和剩余的GTP呈正比，而和GTPase活性呈反比。UA-Glo® GTPase检测试剂盒可以用于检测GTPase的固有活性、GAP刺激的GTPase 活性、GAP 活性和GEF活性。该试剂盒具有检测信号信噪比高、重复性好、稳定性好的特点，尤其适合化合物的高通量筛选实验。

产品规格

  • 储存条件

    干冰运输。避光储存于-20℃ 及以下, 建议长期 (>3个月) 保存于-80℃，有效期见瓶标签。初次使用后建议将试剂按需分装避光-20℃及以下保存，避免反复冻融。ATP检测试剂分装时需要小心避免ATP污染。

产品组分

  • UA-Glo® GTPase检测试剂盒组分和规格如下。可检测的样品数384-孔板 (低容量) 按照样品为GTPase 反应5 μL，加入G2A转化试剂5 μL和ATP检测试剂10 μL计算。96-孔板可检测样品数按三者为25 μL，25 μL和50 μL计算。

    规格

    组分和规格

    检测96-孔板孔数

    检测 384-孔板孔数

    1000assays

    GTPase/GAP 缓冲液：5 mL

    GEF缓冲液：5 mL

    G2A缓冲液：5 mL

    G2A反应试剂 (500x)：15 μL

    ADP (10mM)：100 μL

    ATP检测试剂：10 mL

    rGTP (10mM)：100 μL

    DTT(100mM)：100 μL

    200

    1,000

    10000assays

    GTPase/GAP 缓冲液：50 mL

    GEF缓冲液：50 mL

    G2A缓冲液：50 mL

    G2A反应试剂 (500x)：120 μL

    ADP (10mM)：100 μL

    ATP检测试剂：100 mL

    rGTP (10mM)：100 μL

    DTT(100mM)：1.25 mL

    2,000

    10,000


操作步骤

  • UA-Glo® GTPase检测试剂盒通过荧光素酶反应检测ATP的含量来测定GTPase的酶活。荧光素酶反应有极高的灵敏度，并且pH, 温度，实验系统设定等参数对反应均有较大影响，多数实验条件下不建议直接比较样品绝对检测值。建议在每块实验板设定同样的参照化合物，实验样品检测值用参照化合物和溶剂载体对照检测值归一化后再进行数据处理和比较。

    1. GTPase活性检测

    以下以384-孔实验板为例说明GTPase活性的检测。

    1)按实验需要设定检测GTPase的固有活性、GAP刺激的GTPase 活性、GAP 活性和GEF活性的酶反应，可参考以下3.2，3.3，3.4，3.5节，反应体系为10 μL

    2)取出G2A缓冲液，完全融化后平衡至室温(22℃-25℃)，颠倒充分混匀

    3)取出G2A反应试剂 (500x) 和ADP (10mM)，完全融化后置于冰上

    4)配制G2A转化试剂：按每孔加入10 μL计算所需G2A转化试剂，以配制1mL为例：998 μL G2A缓冲液+ 2 μL G2A反应试剂 (500x) + 0.5 μL ADP (10mM)

    5)取出实验步骤1的酶反应实验板，每孔加入10 μL G2A转化试剂，振板混匀，室温孵育0.5hr

    6)取出ATP检测试剂，完全融化后颠倒充分混匀。按每孔加入20 μL取所需ATP检测试剂，平衡至室温。荧光素酶反应对温度变化敏感。ATP检测试剂和酶反应实验板需要平衡至室温，测试过程温度保持恒定（±1℃）

    7)步骤5酶反应实验板每孔加入20 μL ATP检测试剂，振板1min，放置暗处孵育10min

    8)在发光或多功能读板仪上读取发光信号。信号非常稳定，可以在2-3hr内读板

    2. GTPase酶反应

    以下以384-孔实验板为例说明GTPase酶反应的实验设定。GTPase酶反应中GTP终浓度为5 μM，建议在GTPase酶反应中使用不超过5 μM的GTP。检测GTPase固有活性时可以用1 μM GTP。最佳GTP的浓度可能需要根据具体GTPase酶反应优化。试剂盒的GTPase/GAP 缓冲液和GEF缓冲液适合于多数GTPase酶反应，某些GTPase酶反应可能需要额外的金属离子或辅助因子增强酶活，请参考相关文献确定是否需要加入。

    1)制备 2X GTP 反应液：GTPase/GAP 缓冲液加入GTP至10μM，DTT至1mM

    2)用GTPase/GAP 缓冲液对GTPase做梯度稀释(或稀释为一个适当浓度)，加入5 μL至384-孔白色实验板

    3)加入5 μL步骤1制备 2X GTP反应液

    4)室温孵育1hr-2hr，最佳孵育时间可能需要根据具体GTPase优化

    5)进行GTPase活性检测，具体操作见3.1节【GTPase活性检测】

    3. GAP刺激的GTPase酶反应

    1)制备 2X GTP-GAP反应液：GTPase/GAP 缓冲液加入GTP至10μM，DTT至1mM和相关的GAP蛋白浓度2x于设定的在GTPase酶反应的浓度

    2)用GTPase/GAP 缓冲液对GTPase做梯度稀释(或稀释为一个适当浓度)，加入5 μL至384-孔白色实验板

    3)加入5 μL步骤1制备2X GTP-GAP反应液

    4)室温孵育1hr-2hr，最佳孵育时间可能需要根据具体GTPase优化

    5)进行GTPase活性检测，具体操作见3.1节【GTPase活性检测】

    4. GAP活性检测

    1)制备 2X GTPase反应液：GTPase/GAP 缓冲液加入DTT至1mM和GTPase浓度2x于设定的在GTPase酶反应的浓度

    2)用含有10 μM GTP的GTPase/GAP 缓冲液对相关GAP蛋白做梯度稀释(或稀释为一个适当浓度)，加入5 μL至384-孔白色实验板

    3)加入5 μL步骤1制备2X GTPase反应液

    4)室温孵育1hr-2hr，最佳孵育时间可能需要根据具体GTPase优化

    5)进行GTPase活性检测，具体操作见3.1节【GTPase活性检测】

    5. GEF活性检测

    1)制备 2X GTPase-GAP反应液：GEF缓冲液加入DTT至1mM，GTPase和相关GAP蛋白浓度2x于设定的在GTPase酶反应的浓度

    2)用含有10 μM GTP的GEF缓冲液对相关GEF蛋白做梯度稀释(或稀释为一个适当浓度)，加入5 μL至384-孔白色实验板

    3)加入5 μL步骤1制备2X GTPase-GAP反应液

    4)室温孵育1hr-2hr，最佳孵育时间可能需要根据具体GTPase优化

    5)进行GTPase活性检测，具体操作见3.1节【GTPase活性检测】

注意事项

  • 1)不同批次不建议混用

    2)非经严格验证，不建议改变检测试剂用量

    3)仅限科研用途

  • 生物活性

    • HRAS/GAP+GEF 活性测试: GTPase/GAP/GEF反应为10uL， 在白色96-孔实验板孵育1hr后加入G2A转化试剂10μL，振荡混匀孵育0.5hr, 加入ATP检测试剂，振荡混匀后于10min-180min读板。10min测试结果见右图:右上图为绝对检测值RLU，右下图为相对于无HRAS的酶活性。注意值越低表明酶活越强。检测信号非常稳定，半衰期 >3hr

    • HRAS/GAP+GEF 活性测试: GTPase/GAP/GEF反应为10uL， 在白色96-孔实验板孵育1hr后加入G2A转化试剂10μL，振荡混匀孵育0.5hr, 加入ATP检测试剂，振荡混匀后于10min-180min读板。10min测试结果见右图:右上图为绝对检测值RLU，右下图为相对于无HRAS的酶活性。注意值越低表明酶活越强。检测信号非常稳定，半衰期 >3hr

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