UA-Glo^® Glycogen Luminescence Detection Kit

UA-Glo® 糖原发光法检测试剂盒通过葡萄糖淀粉酶将糖原消化为葡萄糖，再由葡萄糖脱氢酶，还原酶和荧光素酶的偶联反应检测葡萄糖含量。荧光素酶反应有极高的灵敏度，并且pH，温度，实验系统设定等参数对反应均有较大影响，多数实验条件下不建议直接比较样品绝对读值。建议在每块实验板设定同样的参照化合物和溶剂载体对照，实验样品读值用参照化合物和溶剂载体对照读值归一化后再进行数据处理和比较。也可以在每块实验板设立和样品同样方式处理的糖原标准品以定量样品的糖原含量。

3.1样品处理

UA-Glo® 糖原发光法检测试剂可用于检测细胞裂解液和组织匀浆等样品中的糖原浓度。糖原线性最高检测浓度为20μg/mL。如果样品糖原浓度 >20μg/mL，可以参考下表对样品做适当的处理和稀释，或用户根据具体实验优化样品稀释度。

建议使用试剂盒中的0.3N HCl和Tris 缓冲液 (450mM Tris, pH-8.0) 进行样品处理。0.3N HCl的酸处理可以快速裂解细胞和终止细胞代谢，并且灭活细胞内的酶和降解还原型NAPD(P)H，如此处理后细胞内的酶和还原型NAPD(P)H就不会干扰后续的糖原检测。酸处理后，在样品中加入Tris 缓冲液，pH值略有升高，但不会使酸处理失效。0.3N HCl和Tris 缓冲液 (450mM Tris, pH-8.0) 的组合可以确保在加入葡萄糖淀粉酶缓冲液后pH值达到葡萄糖淀粉酶反应的最佳pH: 约为pH5。0.3N HCl和Tris 缓冲液处理后的样品可以立即检测或保存于-20℃及以下在未来检测。对于难于裂解的样品，例如3D样品，可以在0.3N HCl中加入终浓度为0.2% 的Triton X 100使代谢物质更有效的释放。

组织匀浆建议用1体积的PBS加1/2体积的0.3N HCl匀浆液进行，匀浆组织后加入1/2体积的Tris 缓冲液。或按下表匀浆后立即依次加入0.3N HCl和Tris 缓冲液。组织的糖原含量差异较大，对于含有高浓度糖原的组织，例如肝组织需要稀释到适当浓度后检测，稀释液为PBS+0.3N HCl+Tris 缓冲液，体积比为2:1:1。

3.2糖原检测实验

3.2.1样品糖原检测

1)96-孔白色 (底不透明) 实验板加入3.1处理的样品25μL每孔。阴性对照为和样品同样处理的无糖原/葡萄糖培养基或缓冲液，阳性对照可以用和样品同样处理的糖原标准品。荧光素酶反应对温度变化敏感。检测试剂和样品需要平衡至室温(22-25℃)，测试过程温度保持恒定 (±1℃)

2)取出葡萄糖淀粉酶缓冲液，室温完全融化后颠倒充分混匀，取实验所需体积，剩余葡萄糖淀粉酶缓冲液可按需分装保存于-20℃

3)葡萄糖淀粉酶于室温融化，置于冰上。葡萄糖淀粉酶母液为200x，用葡萄糖淀粉酶缓冲液配为1x葡萄糖淀粉酶消化液，颠倒充分混匀。消化液按需现配现用，不建议保存。剩余葡萄糖淀粉酶立即按需分装，保存于-80℃

4)每孔加入25μL葡萄糖淀粉酶消化液，振板1min混匀

5)室温孵育60min

6)取出UA-Glo® 糖原发光法检测试剂盒的荧光素检测液，完全融化后颠倒充分混匀。取实验所需体积的荧光素检测液，平衡至室温。剩余荧光素检测液按需分装，保存于-80℃。荧光素检测液冻融次数不超过3次

7)葡萄糖检测试剂配置：检测前取出还原酶底物室温融化，置于冰上，按200x加入荧光素检测液，颠倒充分混匀，此为葡萄糖检测试剂。葡萄糖检测试剂配置后应立即使用，否则会增加检测背景值。检测试剂按需现配现用，不建议保存。剩余还原酶底物立即按需分装，避光保存于-80℃，还原酶底物冻融次数不超过3次

8)每孔加入葡萄糖检测试剂50μL。处理后的样品加入的体积、葡萄糖淀粉酶消化液体积和葡萄糖检测试剂的比例应为1:1:2。例如用低容积384-孔板检测时，可以加入5μL处理后的样品、5μL葡萄糖淀粉酶消化液和10μL检测试剂进行检测

9)振板1min混匀，放置暗处孵育60-90min。检测信号会持续增加，直至所有的葡萄糖被消耗完，信号强度在检测范围内保持线性

10)在发光或多功能读板仪上读取发光信号

3.2.2细胞培养板细胞裂解物糖原检测

1)在96孔细胞培养板接种合适密度的实验细胞，例如每孔5,000-50,000细胞

2)根据实验需要进行细胞处理；

3)弃去培养基，用200μL 冷的PBS 洗细胞五次以去除培养基残存葡萄糖。培养基中的高浓度葡萄糖需要通过PBS洗涤去除；此步应快速操作以尽量减少糖原代谢的变化

4)每孔加入30μL PBS

5)每孔加入15μL的0.3N HCl溶液，振荡5min混匀。PBS和0.3N HCl也可以按2：1混合后一起加入实验板，即每孔加入45μL此混合液，振板5min混匀

6)加入15μL的Tris 缓冲液 (450mM, pH-8.0)，振荡1min混匀

7)如有需要，可将样品保存于-20℃及以下在未来检测

8)96孔白色 (底不透明) 实验板每孔加入25μL处理后的样品、阳性对照和阴性对照。如果样品含有较高葡萄糖，例如组织样品，同一样品需同时设定两孔，在【3.2.1样品葡萄糖浓度检测】时一孔加入葡萄糖淀粉酶消化液，一孔加入不含葡萄糖淀粉酶的葡萄糖淀粉酶缓冲液，两孔检测的差值即为糖原浓度

9)按【3.2.1样品葡萄糖浓度检测】进行糖原检测