UA-Glo^®BRET Intracellular TE Substate/Inhibitor

NanoBRET®实验的检测需要同时检测能量供体NanoLuc®和能量受体的发光强度。NanoLuc®发光的峰值为460nm，示踪剂的发色基团为NanoBRET® 590 Dye或618 Dye时发光的峰值为590-610nm。适用的检测供体发光的滤镜推荐使用460nm附近BP型滤镜，BP为8–80nm，例如Em 450nm/BP80等；检测受体发光的滤镜推荐使用600-610nm附近的LP型滤镜，例如Em 610nm/LP等。适用设备包括可进行BRET检测的多功能读板仪，例如PerkinElmer EnVision®，BMG Labtech CLARIOstar® ，Promega GloMaxR Discover System等。滤镜选择和多功能读板仪NanoBRET®检测参数设定可以参考设备说明和相关文献。

以下实验以检测化合物对NLuc融合靶标蛋白的EC₅₀为例说明UA-Glo® BRET细胞内TE底物和抑制剂在NanoBRET® TE实验中的应用。详细的HEK293转染方法，化合物和示踪剂的使用可以参考相关文献和产品手册，例如Promega的产品手册， Intracellular TE Nano-Glo® Substrate/Inhibitor and Intracellular TE Nano-Glo® Vivazine™/Inhibitor和NanoBRET® Target Engagement Intracellular Kinase Assay, Adherent Format等，或用户根据具体实验进行优化。

1)通过瞬转的方法将带有NLuc融合靶标蛋白质粒转入HEK293细胞

2)将转染的细胞按适当密度接种于96孔透明底白色细胞板中，每孔100μL细胞。接种的培养基建议为Opti-MEM® I 低血清培养基 (无酚红) +1% FBS

3)实验细胞板37℃，5% CO₂孵箱孵育过夜(20-30hr)

4)20x示踪剂准备：转染细胞孵育20-30hr后，按文献/产品手册推荐的或用户优化的示踪剂浓度按需准备20x终浓度的示踪剂。先用DMSO稀释示踪剂至100x, 再用示踪剂稀释液稀释至20x (5%DMSO)。注意用聚丙烯实验管准备示踪剂以减少管壁吸附。

5)待测化合物准备：用DMSO对待测化合物进行梯度稀释，浓度为终浓度的1000x，然后用Opti-MEM® I 低血清培养基 (无酚红) 将1000x 待测试化合物稀释至终浓度的10x

6)实验细胞板每孔孔分别加入5μL 20x示踪剂和10μL 10x待测化合物，对照包括溶剂对照，阳性化合物对照，不含示踪剂的溶剂对照等，振板混合15sec

7)37℃，5% CO₂孵箱孵育2hr 或客户优化的孵育时间

8)3x细胞内TE检测试剂准备：按需用Opti-MEM® I 低血清培养基 (无酚红) 将微荧光素酶底物稀释167x, 微荧光素酶抑制剂稀释500x，颠倒5-10 次轻轻混合。3x细胞内TE检测试剂现配现用，弃掉未使用的检测试剂

9)取出实验细胞板，平衡至室温

10)实验细胞板每孔加入50μL 3x细胞内TE检测试剂，室温孵育2min

11)在可检测NanoBRET^TM的多功能读板仪上读取供体 (例如460nm) 和受体 (例如610nm) 发光信号检测值，建议加入细胞内TE检测试剂10min内读板

12)数据处理：受体 (610nm) 和供体 (460nm) 检测值的比值(BU，此比值X1000 为mBU)为NanoBRET^TM比值。按此公式计算样品和无示踪剂对照的NanoBRET^TM比值。NanoBRET^TM校正比值为样品NanoBRET^TM比值减去无示踪剂对照的NanoBRET^TM比值。