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产品中心 其他检测试剂盒 激酶检测试剂盒

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UA-Glo®ActRIIB Enzyme Activity Inhibitor Screening Kit STAR

价格 ￥8,490.00 （ 1-2周）
货号 UA079045
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产品介绍

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背景介绍

  • Activin 受体 II 型 (ActR IIA和IIB) 是一种跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体，属于TGF-β超家族Ⅱ型受体。ActR IIA/IIB是激活素 (Activin) 和GDF11的主要受体，在与配体结合后，它招募Ⅰ型受体，这些受体磷酸化并激活下游的SMAD2/3信号传导。除此之外，该受体还介导MAPK和PI3K/AKT信号传导通路。

    在治疗肥胖症的II期临床研究中，已经证明抑制ActRII信号通路显著减少脂肪，同时刺激瘦体重(肌肉)的增加。对于肥胖症患者来说，获得显著的脂肪减少并同时保持或增加瘦体重是一项关键需求，无论作为单药治疗还是与促胰素 (GLP-1) 基础疗法相结合，ActRII抑制是临床上唯一证明能够实现这一有益整体身体组成改变的机制。

    激酶ADP检测试剂可以定量测定酶学实验中激酶的活性。该试剂通过定量检测激酶反应产物ADP的数量以确定激酶的活性： ADP的数量和激酶活性呈正相关。 使用激酶ADP检测试剂时激酶反应中的ATP浓度最高可至1mM。该试剂盒可以检测多数激酶，激酶底物包括多肽，蛋白，脂或糖等。该试剂盒可用于激酶抑制物的高通量均相筛选，并可以通过调整ATP浓度区分ATP竞争性和非竞争性抑制物。该试剂盒也可以用于检测任何产生ADP的酶的活性，例如ATPase。

    ActR IIB抑制剂筛选试剂盒包含ActR IIB 酶蛋白，底物 (Substrate)，激酶反应缓冲液 (1x Assay buffer)，激酶ADP检测试剂等，可以用于检测化合物对ActR IIB酶活性的作用，特别适合ActR IIB抑制剂的高通量筛选。

产品规格

  • 储存条件

    干冰运输。试剂有效期见试剂瓶标签。
    收到试剂盒后，Substrate，ATP和ADP应-80℃避光储存，首次使用后应按需分装并于-80℃避光储存，避免反复冻融。ActR IIB酶蛋白对冻融敏感，首次使用后按单次使用量分装，-80℃储存，冻融次数不超过3次。1x Assay buffer首次使用后可保存于4℃或按需分装保存于-20℃。加入DTT的1x Assay buffer D工作液应现配现用。
    ATP去除试剂和ADP检测试剂避光储存于-20℃及以下, 建议长期（>3个月）保存于-80℃。首次使用后按需分装并于-20℃及以下避光储存。ATP去除试剂和ADP检测试剂反复冻融7次信号强度和功能无损失，放置于室温 (22℃) 24hr或4℃ 7天信号强度和功能无损失。

产品组分

  • ActR IIB抑制剂筛选试剂盒组分和规格如下。可检测的反应数按照实验板为384-孔板，每孔5μL激酶反应，反应条件按说明书的示例计算。

    种属： Human

    分子别名： ACVR 2B, Activin receptor type IIB, ACTR IIB

    组分和规格

    组分

    存储条件

    500T

    1000T

    ActR IIB (750 μg/mL)

    -80 °C

    50μL

    50μL*2

    Substrate (500 μM), 250X

    -80 °C

    12μL

    24μL

    DTT (50 mM)

    -20 °C

    5μL

    10μL

    1X Assay buffer

    -20 °C

    5mL

    10mL

    ATP去除试剂

    -20 °C

    2.5mL

    5mL

    ADP检测试剂

    -20 °C

    5mL

    10mL

    ATP (10mM)

    -80 °C

    0.25mL

    0.5mL

    ADP (10mM)

    -80 °C

    0.25mL

    0.5mL


操作步骤

  • ActR IIB激酶反应的体系1x Assay buffer，ActR IIB酶终浓度 (15ug/mL)，底物 (Substrate) 终浓度(2μM)，ATP 终浓度(10μM)为优化后的反应条件。客户可以根据需要进一步优化。

    ActR IIB激酶反应在96孔或384孔白不透明实验板中进行。建议96孔板反应体积为25μL，384孔板反应体积为5μL。可以在激酶反应中加入浓度梯度的测试化合物。激酶反应的温度和时间建议室温(23℃-25℃)，1hr 进行，或客户优化的温度和时间。激酶反应结束后不需要加入额外试剂终止激酶反应。如果因特殊实验要求需要加入激酶反应终止试剂，避免使用镁离子螯合剂，例如EDTA。 激酶ADP检测反应需要镁离子。

    一些市售ATP含有ADP残余，由于 激酶ADP检测试剂的高度灵敏性，ATP中的ADP残余会导致高实验背景，因此激酶反应需使用高纯度的ATP，可以使用试剂盒自带ATP，或其他高纯度ATP，例如Sigma-Aldrich所售 ATP, Cat# A2383 (纯度≥99%）或其他更高纯度的ATP。

    以下实验示例为测试ActR IIB抑制剂的IC50，激酶反应体积为5μL，ActR IIB酶终浓度为15ug/mL，底物 (Substrate) 终浓度为2μM，ATP 终浓度为10μM，DMSO终浓度不超1%。如果用户有可以处理极微小体积的液体处理和分液器，建议在化合物配制步骤直接用100% DMSO配制梯度稀释的测试化合物，可以加入例如25nL (200x测试浓度)化合物至384-孔实验板，后续加入的激酶反应工作液和底物工作液的体积和浓度做相应调整，例如加入4μL 1.25x激酶反应液和 1μL 5x底物工作液，只要激酶反应的终浓度和上述一致即可。

    ActR IIB激酶反应

    1)配制1x Assay buffer D工作液：根据实验需要取所需1x Assay buffer，加入DTT至终浓度为50μM，此为1x Assay buffer D工作液，用于配置后续化合物、蛋白、底物等工作液，每次实验应现配现用

    2)化合物配制： 使用1x Assay buffer D工作液配制5x终浓度的3x梯度稀释的测试化合物。注意有机溶剂，例如DMSO的浓度在此步骤不应超过3%，如此在步骤5加入ActRII A激酶反应液后DMSO浓度不超1%

    3)将梯度稀释的测试化合物1μL/孔加入384-孔白色 (底不透明) 实验板。需要设立相应的溶剂对照孔，阳性化合物对照孔和无酶对照孔

    4)根据实验需要取所需1x Assay buffer D，加入ActR IIB至37.5μg/mL (或客户优化的酶浓度)，轻轻吹打混匀，此为2.5x 的激酶反应液

    5)将2.5x的ActR IIB激酶反应液2μL/孔加入步骤3准备的含有1μL (5x终浓度) 梯度稀释的测试化合物的384-孔实验板，无酶对照孔加入2μL/孔 1x Assay buffer D工作液

    6)室温孵育15min使测试化合物和ActR IIB酶相结合

    7)配制2.5x底物工作液：根据实验需要取所需1x Assay buffer D工作液，加入Substrate至5μM和ATP至25μM，吹打/颠倒混匀，此为2.5x底物工作液

    8)将2.5x底物工作液2μL/孔加入步骤6的384-孔实验板, 开始激酶反应

    9)振板混匀，室温孵育(23℃-25℃)，1hr

    10)按以下进行ADP检测

    ActRII A激酶反应后的ADP检测

    1.激酶反应后ATP的去除

    1)取出 激酶ATP 去除试剂，融化后平衡至室温，颠倒混匀。ADP检测试剂中的荧光素酶反应对温度变化敏感。试剂和测试样品/实验板需要平衡到室温(23℃-25℃)，测试过程温度保持恒定（±1℃）

    2)加入5 µL/孔ATP去除试剂到以上5 µL/孔激酶反应的384-孔实验板中，振荡混匀。激酶反应，ATP去除试剂和ADP检测试剂的体积比应为1：1：2

    3)室温孵育40min

    2.ADP检测

    1)取出 激酶ADP检测试剂，融化后平衡至室温，颠倒混匀。ADP检测试剂融化后可能会有少许沉淀，可以直接使用上清试剂或离心去除沉淀后使用

    2)加入10 µL/孔的ADP检测试剂到以上去除ATP的384-孔实验板中，振荡混匀。室温暗处孵育40min

    3)在发光仪或多功能读板仪上读取发光信号。最快可以在加入ADP检测试剂后30min读取发光信号。由于信号非常稳定，如有需要，可以在加入检测试剂后3小时内或更长时间读板

注意事项

  • 1)不同批次不建议混用

    2)非经严格验证，不建议改变检测试剂用量

    3)仅限科研用途

  • 生物活性

    • UA-Glo ActR IIB 抑制剂筛选试剂盒和优化的激酶反应条件对ActR 抑制剂LDN-193189检测的结果EC50 为41nM。激酶反应的酶浓度在10-15μg/mL 时，最高信号/背景（溶剂对照/无酶对照，S/B）>10, 适合用于 ActR IIB抑制剂的高通量筛选。注意测试 S/B实验的ActR IIB酶为初次使用，测试EC50实验的酶冻融了3次。

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