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UA-Glo® Kinase ADP Assay with PI3K Substrate PIP2:3PS

价格 ￥6,240.00 （ 供应商现货 ： 3-5个工作日）
货号 UA079043
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产品介绍

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背景介绍

  • 磷脂酰肌醇二磷酸（Phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate, PIP2)和磷脂酰肌醇三磷酸phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate , PIP3) 是磷脂酰肌醇 (PI) 衍生物。PIP2和PIP3通过动态磷酸化/去磷酸化参与多种细胞生理过程。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）是通过磷酸化磷脂酰肌醇衍生物介导信号传导的关键酶类，其激活的PI3K/Akt信号通路在细胞增殖、代谢调控及免疫应答中发挥核心作用。一类磷脂酰肌醇-3-激酶 (PI3K Class I)通过磷酸化PIP2生成的PIP3可以参与生长因子受体介导的下游级联反应，其介导的信号异常与肿瘤发生发展的机制高度相关。

    UA-Glo®激酶ADP检测试剂可以定量测定酶学实验中激酶的活性。该试剂通过定量检测激酶反应产物ADP的数量以确定激酶的活性： ADP的数量和激酶活性呈正相关。 使用UA-Glo®激酶ADP检测试剂时激酶反应中的ATP浓度最高可至1mM。该试剂盒可以检测多数激酶，激酶底物包括多肽，蛋白，脂或糖等。该试剂盒可用于激酶抑制物的高通量均相筛选，并可以通过调整ATP浓度区分ATP竞争性和非竞争性抑制物。该试剂盒也可以用于检测 任何产生ADP的酶的活性，例如ATPase.

    UA-Glo® 激酶ADP检测试剂盒 (含PI3K底物PIP2) 包括激酶ADP检测试剂和优化的PI3K底物PIP2:3PS，可以用于PI3K (Class I) 抑制剂的高通量筛选。

产品规格

  • 储存条件

    干冰运输。收到试剂盒后，PIP2:3PS底物，ATP和ADP应-80℃避光储存，首次使用后应按需分装并于-80℃避光储存；ATP去除试剂和ADP检测试剂避光储存于-20℃及以下, 建议长期（>3个月）保存于-80℃，首次使用后应分装并于-20℃及以下避光储存。ATP去除试剂和ADP检测试剂反复冻融7次信号强度和功能无损失，放置于室温 (22℃) 24hr或4℃ 7天信号强度和功能无损失。5x PI3K激酶反应缓冲液，10x PIP2:3PS稀释缓冲液和MgCl2 -20℃及以下避光储存。试剂有效期见试剂瓶标签。

产品组分

  • UA-Glo® 激酶ADP检测试剂盒 (含PI3K底物PIP2:3PS) 组分和规格如下。可检测96-/384-孔板反应数按每孔25μL / 5μL激酶反应计算。

    规格

    组分

    96-孔板反应数

    384-孔板反应数

    1,000 assays

    PIP2:3PS (1mg/mL): 0.25mL

    10x PIP2:3PS稀释缓冲液: 1mL

    MgCl2(1M): 1mL

    5x PI3K激酶反应缓冲液: 1.5mL

    ATP去除试剂: 5mL

    ADP检测试剂: 10ml

    ATP (10mM):0.5mL

    ADP (10mM): 0.5mL

    200

    1,000

    10,000 assays

    PIP2:3PS (1mg/mL): 10x0.25mL

    10x PIP2:3PS稀释缓冲液: 5x1mL

    MgCl2 (1M): 1mL

    5x PI3K激酶反应缓冲液: 15mL

    ATP去除试剂: 50mL

    ADP检测试剂: 100ml

    ATP (10mM): 5mL

    ADP (10mM): 5mL

    2,000

    10,000


操作步骤

  • PI3K激酶反应在96孔或384孔白色不透明实验板中进行。建议96孔板反应体积为25μL，384孔板反应体积为5μL。可以在激酶反应中加入浓度梯度的测试化合物。PI3K激酶反应的温度和时间建议室温(23℃-25℃)，1hr 进行，或客户优化的温度和时间。激酶反应结束后不需要加入额外试剂终止激酶反应。如果因特殊实验要求需要加入激酶反应终止试剂，避免使用镁离子螯合剂，例如EDTA。UA-Glo® 激酶ADP检测反应需要镁离子。

    试剂盒自带5x PI3K激酶反应缓冲液，用户也可使用自己优化的PI3K激酶反应缓冲液和辅助因子，建议将PI3K激酶反应缓冲液配制为5x母液。

    激酶反应的PI3K激酶浓度需要参考激酶供应商的说明书进行优化，在实验所需的适当信噪比的情况下，可以采用在信号线性反应范围的激酶浓度进行实验。

    PI3K激酶反应的PIP2:3PS底物终浓度为0.05mg/mL。ATP 浓度建议为25μM或用户优化的浓度。一些市售ATP含有ADP残余，由于UA-Glo® 激酶ADP检测试剂的高度灵敏性，ATP中的ADP残余会导致高实验背景，因此激酶反应需使用高纯度的ATP，可以使用试剂盒自带ATP，或其他高纯度ATP，例如Sigma-Aldrich所售 ATP, Cat# A2383 (纯度≥99%）或其他更高纯度的ATP。

    以下实验示例为测试PI3K抑制剂的IC50，PI3K激酶反应为25μL。

    PI3K激酶反应

    1)配制10x终浓度的2x或3x梯度稀释的测试化合物。将梯度稀释的测试化合物2.5μL/孔加入96- 孔白色 (底不透明) 实验板。需要设立相应的溶剂对照孔，阳性化合物对照孔和无酶对照孔。溶剂例如DMSO在激酶反应的终浓度不应超过1%

    2)PI3K激酶反应缓冲液母液为5x , 按需用无菌超纯水1:1稀释为2.5x

    3)PIP2:3PS底物母液浓度为20x (1mg/mL) , 根据需要按以下步骤用10x PIP2:3PS稀释缓冲液稀释为2.5x PIP2:3PS底物

    a)取出PIP2:3PS底物母液，融化后平衡至室温

    b)剧烈震荡至少1min混匀

    c)按需用10x PIP2:3PS稀释缓冲液稀释为2.5x PIP2:3PS底物: 例如125μL PIP2:3PS 底物加入250μL 10x PIP2:3PS稀释缓冲液，再加入无菌超纯水至1mL

    d)剧烈震荡至少1min混匀

    4)根据需要按1:1 混合步骤2配制的2.5x PI3K激酶反应缓冲液和步骤3配制的2.5x PIP2:3PS底物，此为1.25x的PI3K激酶反应缓冲液/PIP2:3PS，震荡混匀

    5)1.25x的PI3K激酶反应缓冲液/PIP2:3PS中加入PI3K至优化的酶浓度，吹打/颠倒混匀，此为1.25x PI3K激酶工作液

    6)将1.25x PI3K激酶工作液20μL/孔加入步骤1准备的含有2.5μL (10x终浓度) 梯度稀释的测试化合物的96-孔实验板，无酶对照孔加入20μL/孔 1.25x的PI3K激酶反应缓冲液/PIP2:3PS

    7)室温孵育10-20min使测试化合物和PI3K酶相结合

    8)加入ATP开始激酶反应: 用无菌超纯水稀释试剂盒自带的10mM ATP 至250μM。向步骤7的96-孔实验板每孔加入250μM ATP 2.5μL。ATP终浓度为25μM，激酶反应体积为25μL

    9)振板混匀，室温孵育(23℃-25℃)，1hr

    10)按以下进行ADP检测

    PI3K激酶反应后的ADP检测

    1.激酶反应后ATP的去除

    1)取出UA-Glo® 激酶ATP 去除试剂，融化后平衡至室温，颠倒混匀

    2)加入MgCl2至UA-Glo® 激酶ATP 去除试剂至终浓度为10mM, 颠倒混匀

    3)如果激酶反应是在非室温，例如30℃进行反应的，平衡实验板至室温。ADP检测试剂中的荧光素酶反应对温度变化敏感。试剂和测试样品/实验板需要平衡到室温，测试过程温度保持恒定（±1℃）

    4)加入25 µL/孔ATP去除试剂到以上25 µL/孔激酶反应的96-孔实验板中，振荡混匀。激酶反应，ATP去除试剂和ADP检测试剂的体积比应为1：1：2

    5)室温孵育40分钟。

    2.ADP检测

    1)取出UA-Glo® 激酶ADP检测试剂，融化后平衡至室温，颠倒混匀。ADP检测试剂融化后可能会有少许沉淀，可以直接使用上清试剂或离心去除沉淀后使用

    2)加入50 µL/孔的ADP检测试剂到以上去除ATP的96-孔实验板中，振荡混匀。室温暗处孵育40min

    3)在发光仪或多功能读板仪上读取发光信号。最快可以在加入ADP检测试剂后30min读取发光信号。由于信号非常稳定，如有需要，可以在加入检测试剂后3小时内或更长时间读板

注意事项

  • 1)不同批次不建议混用

    2)非经严格验证，不建议改变检测试剂用量

    3)仅限科研用途

  • 生物活性

    • 使用优爱生物优化的PI3K底物对PI3K抑制剂LY294002检测的结果无论是EC50（和文献报道用ADP Glo实验检测相符）， 酶活最高值（溶剂对照），背景（无酶对照），最高信号/背景（S/B）均和使用PC品牌的底物的测试结果相当。

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