UA-Glo^® LDH Luminescence Cytotoxicity Assay

UA-Glo® LDH发光法细胞毒性检测试剂盒通过LDH，还原酶和荧光素酶的偶联反应检测释放到细胞外的LDH含量来测定细胞的健康状态。荧光素酶反应有极高的灵敏度，并且pH，温度，实验系统设定等参数对反应均有较大影响，多数实验条件下不建议直接比较样品绝对读值。建议在每块实验板设定同样的参照物，例如肿瘤细胞细胞毒实验设定同样的毒性参照化合物和溶剂载体对照，样品检测值用毒性参照化合物和溶剂载体对照检测值归一化后再进行数据处理和比较。UA-Glo® LDH发光法细胞毒性检测实验可以按以下公式计算细胞毒性(%)：细胞毒性(%) = 100x (样品检测值-溶剂载体对照检测值)/(最大LDH释放对照检测值-溶剂载体对照检测值)。最大LDH释放对照可以是毒性参照化合物对照或溶剂载体对照加入Triton X 100 至终浓度0.2%裂解细胞10-15min后收集的上清。

试剂盒带有一管LDH阳性对照用来验证试剂和确认LDH检测的线性范围。LDH阳性对照可以用LDH储存液 (配方见1.4) 稀释为30mU/mL，此为LDH阳性对照的最高浓度。从30mU/mL浓度起用LDH储存液进行7-8个梯度的2x稀释，可以用此浓度梯度测试和绘制LDH的标准曲线。

UA-Glo® LDH发光法细胞毒性检测试剂盒可以用于肿瘤细胞，原代细胞，3D细胞模型，干细胞和ADCC实验等的细胞毒检测，以下示例为96孔细胞板的化合物细胞毒实验。

1.实验样品准备：

1)96孔细胞培养板接种合适密度的实验细胞，每孔100μL 培养基

2)根据实验需求进行细胞化合物处理。每块实验板应设定毒性参照化合物和溶剂载体对照用于实验检测值的归一化处理

3)根据实验需要可以在细胞处理后多个时间点取样进行LDH检测

4)取样时可以从细胞培养基取2-5μL，按20x稀释加入LDH储存液 (200mM Tris-HCl (pH 7.3), 10% 甘油, 1% BSA)。稀释的样品可以立即检测或保存于–20°C或以下直至检测。不能用培养基或其他缓冲液例如PBS稀释LDH，如此稀释和冻存会极大降低LDH的活性

2.LDH 发光法细胞毒性检测

1)LDH 检测试剂按以下步骤2)-4) 在加入样品前按需现配，例如用96-孔实验板检测可以按照50 µL样品加入50 µL LDH 检测试剂计算所需，用384-孔实验板检测可以按照10 µL样品加入10 µL LDH 检测试剂计算所需

2)取出UA-Glo® LDH 检测液和还原酶底物，室温 (22℃-25℃) 融化后，还原酶底物置于冰上

3)LDH检测液完全融化后平衡至室温，颠倒充分混匀。荧光素酶反应对温度变化敏感。检测试剂和样品需要平衡至室温，测试过程温度保持恒定 (±1℃)

4)还原酶底物为200x，按1x加入LDH 检测液配制为LDH检测试剂，颠倒充分混匀。初次使用还原酶底物后应按需分装避光保存于-80℃，避免反复冻融

5)取出保存的20x稀释的样品，多数实验可以用LDH储存液再进行2x-5x稀释(即样品最终稀释度为40x-100x)后进行检测。最佳样品稀释倍数可能需要根据具体实验参数，例如细胞数，培养基是否含血清 (某些品牌血清可能含有较多LDH)等通过预实验来确认以保证LDH 检测在线性范围内。也可以参考下表“样品稀释倍数参考”进行样品稀释

6)白色(最好底不透明) 96-孔实验板每孔加入50 µL 稀释的样品，再加入50 µL LDH检测试剂

7)中速振板1min混匀，放置暗处孵育30min-60min

8)发光或多功能读板仪上读取发光信号。可以在加入LDH检测试剂后60min以后读板，但是需要确保读板时信号仍在线性区间内并且所有信号均处于增长期

样品稀释倍数参考