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产品中心 其他检测试剂盒 荧光素酶检测试剂盒

UA-Glo® BRET Detection System

价格 ￥1,100.00 （ 供应商现货 ： 3-5个工作日）
货号 UA079039
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产品介绍

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背景介绍

  • UA-Glo® BRET检测试剂盒包括UA-Glo® BRET Ligand 618和UA-Glo® BRET微荧光素酶底物。UA-Glo® BRET Ligand 618可以作为NanoBRET®实验中的能量受体，而UA-Glo® BRET微荧光素酶底物可以作为NanoLuc®的底物经NanoLuc®作用产生供体发光信号，二者配合使用可以作为NanoBRET®实验的检测试剂。UA-Glo® BRET Ligand 618进入活细胞后通过卤代基团和带有Halo-Tag®的融合蛋白A的Halo-Tag®以共价键结合。当BRET Ligand 618标记的Halo-Tag®融合蛋白A与带有NanoLuc®的融合蛋白B相互结合，并且存在微荧光素酶底物例如UA-Glo® BRET微荧光素酶底物的情况下，NanoLuc®融合蛋白B和底物反应产生的光能可以被附近的BRET Ligand 618吸收，而BRET Ligand 618激发后发出的红光可被定量检测，并且和蛋白A, B结合程度/数量有正比关系。同时检测NanoLuc®发光值并计算BRET Ligand 618和NanoLuc®发光值的比值可以排除实验误差和背景对检测的影响，极大提高了检测灵敏度。

产品规格

  • 储存条件

    干冰运输。避光储存于-20℃ 及以下, 建议长期（>3个月）保存于-80℃，有效期12个月。

产品组分

  • UA-Glo® BRET检测试剂盒组分和规格如下：

    规格

    BRET Ligand 618

    BRET微荧光素酶底物

    检测96孔板孔数

    检测384孔板孔数

    200 assays

    1x20μL

    1x50μL

    200

    500

    1000 assays

    5x20μL

    5x50μL

    1,000

    2,500

    10000 assays

    1x1mL

    2x1.25mL

    10,000

    25,000


操作步骤

  • NanoBRET实验的检测需要同时检测能量供体NanoLuc®和能量受体BRET Ligand 618的发光强度。NanoLuc®发光的峰值为460nM，BRET Ligand 618发光的峰值为618nM。适用的检测供体发光的滤镜推荐使用460nm附近BP型滤镜，例如Em 450nm/BP80等；检测受体发光的滤镜推荐使用600-610nm附近的LP型滤镜，例如Em 610nm/LP等。适用设备包括可进行BRET检测的多功能读板仪，例如PerkinElmer EnVision®，BMG Labtech CLARIOstar® ，Promega GloMaxR Discover System等。滤镜选择和多功能读板仪NanoBRETTM检测参数设定可以参考设备说明和相关文献。

    以下实验以检测化合物对Halo-Tag®融合蛋白A与NanoLuc® 融合蛋白B相互结合的作用为例说明UA-Glo® BRET检测试剂盒在NanoBRET®实验中的应用。

    1)通过瞬转的方法将Halo-Tag®融合蛋白A和NanoLuc®融合蛋白B共转染入HEK293细胞

    2)转染约20hr后收集细胞，用无酚红Opti-MEM® I培养基加4% FBS重悬适当密度和体积的细胞

    3)UA-Glo® BRET Ligand 618为DMSO溶液，浓度为1000x (0.1mM)，按终浓度1x (0.1μM) 加入步骤2)准备的细胞中并充分混匀。同时设定无BRET Ligand 618的细胞对照，加入DMSO至终浓度0.1%

    4)将3) 准备的细胞按适当密度接种于96孔 (每孔90μL细胞) 或384孔 (每孔36μL细胞) 透明底白色细胞板中

    5)用无酚红Opti-MEM® I培养基加4% FBS将测试化合物稀释为测试终浓度的10X，加入4) 准备的细胞板中：96孔板每孔加入10μL (终体积100μL)，384孔板每孔加入4μL (终体积40μL)。建议加入化合物后DMSO的终浓度不超过0.5%

    6)实验细胞板37℃，5% CO2孵箱孵育至少4-6hr或孵育过夜(18-24hr)。建议孵育过夜

    7)准备NanoLuc®底物：将UA-Glo® BRET微荧光素酶底物用无酚红Opti-MEM® I培养基稀释100倍

    8)取出实验细胞板，加入7) 准备的底物：96孔板每孔加入25μL，384孔板每孔加入10μL，中速振板30s混匀

    9)加入底物10min内在可检测NanoBRETTM的多功能读板仪上读取供体 (460nm) 和受体 (618nm) 发光信号检测值

    数据处理：受体 (618nm) 和供体 (460nm) 检测值的比值(BU，此比值X1000 为mBU)为NanoBRETTM比值。按此公式计算样品和无BRET Ligand 618对照的NanoBRETTM比值。NanoBRETTM校正比值为样品NanoBRETTM比值减去无BRET Ligand 618对照的NanoBRETTM比值。

注意事项

  • 1)不同批次不建议混用

    2)非经严格验证，不建议改变检测试剂用量

    3)仅限科研用途

    4)HaloTag, Nano-Glo 和 NanoLuc 是Promega公司注册商标。NanoBRET是Promega公司商标

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