Fluo-8免洗细胞钙流检测试剂盒

1.根据实验需要接种细胞于96-孔或384-孔底部透明黑色细胞培养板，细胞培养基血清浓度不超过10%。根据实验需要37℃ 5% CO₂孵箱孵育一定时间。

2.取出Fluo-8 装载缓冲液和QF（10x）试剂，平衡至室温，充分混匀。

3.取出Fluo-8 AM，室温溶化，离心收集内容物于管底，置于冰上。如果Fluo-8 AM不是一次性用完，应进行分装，-20℃避光保存，避免反复冻融。

4.按每孔加入和孔内培养基等体积的Fluo-8细胞装载试剂计算所需Fluo-8细胞装载试剂用量

5.Fluo-8细胞装载试剂配制：将10x QF试剂按10倍稀释加入Fluo-8装载缓冲液中，例如1mL 10x QF试剂加入9mL Fluo-8装载缓冲液中, 充分混匀。Fluo-8 AM 为 400X, 按1X加入上述配制的Fluo-8装载缓冲液(含1x QF)，此为Fluo-8细胞装载试剂。

6.某些细胞，例如CHO细胞，需要在Fluo-8细胞装载试剂中加入丙磺舒（Probenecid, Cas 57-66-9）以抑制细胞将进入细胞内的Fluo-8转运出细胞。丙磺舒由客户自己提供，建议加入Fluo-8细胞装载试剂的丙磺舒终浓度为2.5mM。对不同的细胞，最佳浓度可能需要优化。

丙磺舒配制: 用 1N NaOH 配制为500 mM 原液，使用前先用1X HBSS 缓冲液稀释为250 mM后加入Fluo-8细胞装载试剂中，终浓度为2.5mM. (HBSS 缓冲液由客户自己提供，配方为20 mM HEPES buffer pH7.4 + 1X Hank's Balanced Salt Solution, pH 7.4)。

7.标准方法检测：加入和细胞培养板孔内培养基等体积的Fluo-8细胞装载试剂，例如96-孔板每孔100μL培养基加入100μL Fluo-8细胞装载试剂。

（可选检测方法：含有10% FBS的培养基可能会降低读值和增加背景，可以去除孔内培养基，按1：1混合Fluo-8细胞装载试剂（步骤5和6配制）和HBSS缓冲液，加入相当于2倍体积原培养基的此混合液检测。或使用低浓度FBS的培养基进行细胞培养，按步骤7标准方法检测)

8.37℃ 孵育 1小时。具体孵育温度（例如室温或37℃）和时间（0.5hr-2hr或更长）需根据具体实验优化。

9.进行细胞内钙流检测：根据实验需要和检测设备进行检测参数设置，加入测试化合物，底部读数检测荧光强度。适用检测设备包括FlexStation, FLIPR（Molecular Devices ）等。其中FlexStation 3 用Ex/Em = 485/525 nm读取荧光。