UA-Glo^® AMP Assay Kit

1.酶反应实验设定：
1)在96孔或384孔白不透明实验板中进行酶反应。建议96孔板反应体积为25μL，384孔板反应体积为5μL。可以在酶反应中加入浓度梯度的测试化合物。
2)酶和底物浓度需要根据不同的酶反应进行优化。在实验所需的适当信噪比的情况下，可以采用在信号线性反应范围的酶浓度进行实验。由于AMP检测试剂盒的高度灵敏性，酶用量可以极大降低。
3)如果酶反应需要ATP，应使用高纯度的ATP 以获得最优实验结果。一些市售ATP含有ADP残余，由于 AMP检测试剂盒的高度灵敏性，ATP中的ADP残余会导致高实验背景，因此酶反应需使用高纯度的 ATP。可以使用试剂盒自带ATP，或其他高纯度ATP，例如Sigma-Aldrich所售 ATP (Cat# A2383 , 纯度≥99%) 或其他更高纯度的ATP。
4)酶反应可以采用文献报道的反应缓冲液和辅助因子或根据特定实验设定优化后的条件。
5)酶反应的温度和时间需根据不同的酶而设定。进行化合物高通量筛选实验时，建议优化酶反应于室温（22℃-25℃）进行，以利于在 AMP检测过程中保持实验板的温度均一性。
6)酶反应结束后不需要加入额外试剂终止酶反应。如果因特殊实验要求需要加入酶反应终止试剂，避免使用镁离子螯合剂，例如EDTA。AMP检测反应需要镁离子，最终镁离子的浓度必须至少为5mM。

2.酶反应后AMP到ADP的转化和ATP的去除
1)取出AMP GR试剂，平衡至室温（22℃-25℃）。轻摇混匀【注1 2 3】。
2)如果酶反应是在非室温，例如30℃进行反应的，平衡实验板至室温【注4】。
3)加25 µL的AMP GR试剂到以上25 µL 96-孔实验板中（总体积50µL）, 或5 µL AMP GR试剂到5 µL 384- 孔实验板中（总体积10µL）。振荡混匀【注5】。
4)室温孵育40分钟。

3.酶活性测定
1)取出 AMP检测试剂，平衡至室温。轻摇混匀【注4】。
2)加50 µL的AMP检测试剂到 以上50 µL 96-孔实验板中, 或10 µL AMP检测试剂到以上10 µL 384- 孔实验板中，振荡混匀。室温暗处孵育30分钟。
3)可以在加入AMP检测试剂后30-180分钟或更长读取发光信号【注6】。