UA-Glo^® Kinase ADP Max Assay Kit

1.酶反应实验设定：以激酶反应为例

1)在96孔或384孔白不透明实验板中进行激酶反应。建议96孔板反应体积为25μL，384孔板反应体积为5μL。可以在激酶反应中加入浓度梯度的测试化合物。

2)激酶和底物浓度需要根据不同的激酶反应进行优化。在实验所需的适当信噪比的情况下，可以采用在信号线性反应范围的激酶浓度进行实验。由于UA-Glo激酶ADP-Max检测试剂盒的高度灵敏性，激酶用量可以极大降低。

3)激酶反应ATP的浓度最高可至5mM, 不低于0.5mM。对于ATP浓度低于0.5mM的激酶反应建议使用UA-Glo 激酶ADP检测试剂盒（目录号UA070101）以获得最优实验结果。一些市售ATP含有ADP残余，由于激酶ADP-Max检测试剂盒的高度灵敏性，ATP中的ADP残余会导致高实验背景，因此激酶反应需使用高纯度的 ATP。可以使用试剂盒自带ATP，或其他高纯度ATP，例如Sigma-Aldrich所售 ATP (Cat# A2383 , 纯度≥99%) 或其他更高纯度的ATP。

4)激酶反应可以在通用反应缓冲液中进行（40mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 mg/ml BSA, 20mM MgCl2）或采用文献报道的反应缓冲液和辅助因子。

5)激酶反应的温度和时间需根据不同激酶而设定。进行化合物高通量筛选实验时，建议优化激酶反应于室温（22℃-25℃）进行，以利于在激酶ADP-Max检测过程中保持实验板的温度均一性。

6)激酶反应结束后不需要加入额外试剂终止激酶反应。如果因特殊实验要求需要加入激酶反应终止试剂，避免使用镁离子螯合剂，例如EDTA。 激酶ADP-Max检测反应需要镁离子，最终镁离子的浓度必须至少为5mM。

2.激酶反应后ATP的去除

1)取出ATP Max去除试剂，平衡至室温（22℃-25℃）。轻摇混匀【注1 2 3】。

2)如果激酶反应是在非室温，例如30℃进行反应的，平衡实验板至室温【注4】。

3)加25 µL的ATP Max去除试剂到 以上25 µL 96-孔实验板中（总体积50µL）, 或5 µL ATP Max去除试剂到5 µL 384- 孔实验板中（总体积10µL）。振荡混匀【注5】。

4)室温孵育40分钟。

3.激酶活性测定（ADP检测）

1)取出ADP Max检测试剂，平衡至室温。轻摇混匀【注4】。

2)加50 µL的ADP Max检测试剂到 以上50 µL 96-孔实验板中, 或10 µL ADP Max检测试剂到以上10 µL 384- 孔实验板中，振荡混匀。室温暗处孵育30分钟。

3)可以在加入ADP Max 检测试剂后30-180分钟或更长时间读取发光信号【注6】。