① 靶细胞准备
选取并培养适宜的目标细胞系（如肿瘤细胞），根据实验设计进行荧光标记（如CFSE）或预先加载特定抗原，以作为后续检测中的被杀伤对象。

② CD8⁺T细胞分选
从供体（人外周血或小鼠脾脏等）来源的淋巴细胞中，通过免疫磁珠分选或流式细胞分选技术，高纯度地分离获取CD8⁺T细胞。

③ 效应细胞-靶细胞共培养
将分选获得的CD8⁺T细胞（效应细胞）与准备好的靶细胞，按预设的效靶比例于培养板中共同孵育，模拟体内杀伤过程。

④ CD8⁺T细胞杀伤检测
在共培养特定时间后，采用终点法（如乳酸脱氢酶释放法、钙黄绿素释放法）或实时动态监测法（如xCELLigence系统）定量检测靶细胞的裂解程度，以此表征CD8⁺T细胞的直接细胞毒性活性。

⑤ 流式细胞术与ELISPOT分析
流式细胞术分析：可检测共培养后靶细胞的凋亡/坏死标志物（如Annexin V/PI），或胞内细胞因子（如IFN-γ、TNF-α）的表达，从单细胞水平评估杀伤功能及相关免疫表型。
ELISPOT分析：通过检测由CD8⁺T细胞释放的效应分子（如IFN-γ），在单细胞水平定量评估抗原特异性T细胞的频率与功能，作为细胞毒性活性的间接且灵敏的补充指标。