T Cell Activation Nanobeads，Human（RUO）

1.注意事项

1)全程所有操作均需在无菌环境下进行；

2)初次激活需保证试剂与细胞持续作用 2~3 天，过早移除试剂会造成 T 细胞活化不足、增殖能力下降；

3)T细胞可在激活后2天进行病毒转导实验，需自行摸索最佳转导滴度及转导时机；

4)细胞体系中残留 EDTA 会显著抑制T细胞活化刺激，实验前须彻底去除。

2. 样品制备

可采用CD4 Nanobeads, human (Cat. No. S0K0013), CD8 Nanobeads, human (Cat. No. S0K0005)，CD3 Nanobeads, human (Cat. No. S0K0011)，从 PBMC 中分离富集T细胞，具体操作参照对应产品说明书。

人外周血样本需经密度梯度离心法分离获取 PBMC，用于后续T细胞激活实验。

3. 细胞铺板密度与试剂使用标准

本实验方案优化推荐使用1:200工作滴度；分选后T细胞最佳培养铺板密度：1×10⁶ 个 /cm²；PBMC 最佳铺板密度：2×10⁶ 个/cm²。

各培养板最优培养体系配比表

Notes: 细胞数量低于10⁶个时，仍按上表固定体积加样；细胞规模放大时，按比例同步放大试剂、培养基总体积。

4. 48孔板标准激活操作步骤

1)使用AO/PI进行细胞计数，确定细胞用量；

2)用995 μL T细胞完全培养基重悬细胞；

3)加入5 μL T Cell Activation Nanobeads，充分轻柔混匀；

4)置于37℃、5% CO₂ 培养箱静置孵育48 h；

5)初次激活后进行离心换液：

① 300×g 离心 10 min；

② 缓慢完全吸弃上层上清；

③ 按1×10⁶/ml加入新鲜T细胞完全培养基；

④ 置于37℃、5% CO₂ 培养箱继续培养。

5. 细胞扩增培养操作

1)每2天将细胞悬液等体积分孔/分瓶，补充新鲜培养基；

2)维持 37℃、5% CO₂ 常规培养条件；

3)培养至第12天，细胞扩增达到足量水平，可用于后续各类下游实验；

4)依据细胞生长状态与实验设计需求，扩增培养周期最长可延长至 16 天；

5)如需长时间扩增培养，可在培养第12天后重新添加T Cell Activation Nanobeads进行二次活化刺激。