Anti-biotin Nanobeads

步骤

操作方法

剂量 / 时间

磁性标记

1

计数细胞总数

—

2

细胞悬液400×g离心7分钟，完全吸弃上清

400×g,7 min

3

重悬细胞，并根据制造商说明，用生物素化CD3抗体标记细胞。为获得最佳细胞标记效果，建议测试不同的抗体用量。通常，标记10⁷个单核细胞可加入0.1至5 μg抗体。通常在2–8 °C下孵育15分钟即足够。

Note: 通过轻轻吹吸或轻敲管底使抗体与细胞充分混匀

生物素化抗体标记

4

每10⁷细胞加入1–2 mL标记缓冲液洗涤细胞以去除未结合的生物素化抗体，以400×g离心7分钟。完全吸弃上清。

Note:可重复清洗步骤

清洗细胞

5

每10⁷总细胞用90 μL标记缓冲液重悬细胞沉淀

重悬细胞

6

每1×10⁷细胞加10 μL Anti-biotin Nanobeads

Note：细胞量增大时，所有试剂体积按比例同步增加

1×10⁷细胞加 10 μL

7

充分混匀，2–8℃避光孵育15min

孵育15 min

8

每1×10⁷细胞加1 mL缓冲液洗涤，400×g 离心7分钟，完全吸弃上清

1×10⁷细胞加1 mL

9

500 μL缓冲液最多重悬1×10⁸细胞

重悬细胞

磁性分选

10

将S型分选柱放入对应磁力分选器磁场中，500 μL缓冲液润洗分选柱

润洗分选柱

11

将细胞悬液上样至分选柱，收集流出液（未标记细胞）

—

12

缓冲液洗涤柱子3次，每次500μL，待柱内液体完全流空后再加下一次

3×500 μL缓冲液

13

合并所有流出液为阴性组分；将分选柱移出磁场，置于收集管上

—

14

向柱内加入1mL缓冲液，用配套柱塞快速、用力推压，洗脱磁性标记的阳性细胞

Note：如需更高纯度，换用新柱重复分选1次

收集目的细胞

步骤

操作说明

剂量和时间

细胞处理及标记

1

取小鼠脾脏，置于40 μm无菌滤网上研磨，制备脾脏单细胞悬液，裂红处理后进行细胞计数;

Note: 推荐细胞采用 AO/PI 染色后进行计数；脾细胞可以采用400 g离心7 min；

制备样本

2

用100μL MagSep Separation Buffer重悬1×10⁷细胞;

Note:试剂根据样品体积等比例调整； 留分选前样本检测初始T细胞比例；

1×10⁷ cells/100 μL

3

加入10 μL Mouse T cell Biotin Antibody Cocktail至样品中，轻轻混匀；

Note: 本步骤混匀可采用移液器轻轻吹匀2-3下；

10 μL/100 μL

4

Cocktail中的抗体和细胞进行孵育 , 室温孵育10 min；

室温孵育10 min

5

混匀Anti-biotin NanoBeads，加20 μL Anti-biotin NanoBeads至样品中；

20 μL/100 μL

6

轻柔混匀磁珠和细胞，室温孵育5 min；

室温孵育5 min

7

在柱分选磁极中，装上L Separation Column，加入 3 mL MagSep Separation Buffer润洗分选柱；

润洗分选柱

细胞分选

8

将细胞加入到分选柱中，并用收集管收集目的细胞；

Note: 细胞体积最少为500 μL，不足则用MagSep Separation Buffer补齐；随重力滴落的细胞为目的细胞；

收集目的细胞

9

加入3 mL MagSep Separation Buffer，收集目的细胞；

Note: 本步骤洗脱分选柱未标记的目的细胞，提高得率。

收集目的细胞

Notes: 1. 注意分选柱的最大承载量，S Separation Column标记细胞数最大为1×10⁷；L Separation Column最大标记细胞数为1×10⁸；

2. 若样本活率偏低，建议使用去死细胞试剂盒去除死细胞（Dead Cell Removal Set, (RUO)#S0K0009）;