Cas9重组兔单抗，CRISPR 基因编辑检测好帮手-斯达特(Starter),国产抗体专家

Cas9重组兔单抗，CRISPR 基因编辑检测好帮手

作者：斯达特高级产品经理浏览次数：29

CRISPR-Cas9 是一种强大的基因编辑技术，它允许科学家们精确地修改 DNA。这个名字来源于“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”，指的是细菌和古生菌基因组中一种独特的 DNA 序列。

Cas9CRISPR基因编辑

最新进展

CRISPR-Cas9 是一种强大的基因编辑技术，它允许科学家们精确地修改 DNA。这个名字来源于"Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"，指的是细菌和古生菌基因组中一种独特的 DNA 序列。Cas9 是一种酶，它能够切割 DNA。CRISPR-Cas9 原本是细菌为了抵抗噬菌体进化出来的一种防御机制，但是由于起机制的破译，现已成为了一种基因编辑的工具。且随着研究的进一步深入，还发展出了先导编辑，单碱基编辑等更多更加精准的编辑体系。

图 1 CRISPR 系统是细菌/古菌的天然免疫防疫系统

CRISPR 发展历程：

图 2 Key Studies Characterizing and Engineering CRISPR Systems

CRISPR-Cas9 的工作原理：

CRISPR-Cas9 的工作原理可以分解为几个关键部分：

- CRISPR 序列（"指南针"）： CRISPR 序列并非直接用于编辑，而是充当了系统的"指南针"。在细菌的免疫系统中，这些序列是病毒 DNA 的片段，被细菌储存起来，用于识别并对抗未来的病毒感染。

- 向导 RNA (gRNA)： 在基因编辑应用中，科学家会人工合成一种叫做"向导 RNA"（guide RNA，简称 gRNA）的分子。gRNA 由两部分组成：
- CRISPR RNA (crRNA)：这部分序列是经过设计的，与目标 DNA 序列的特定区域（通常是 20 个核苷酸）完全匹配。它就像一个精确的"地址标签"，告诉 Cas9 酶要去 DNA 的哪个位置。
- 反式激活 CRISPR RNA (tracrRNA)：这部分 RNA 负责将 crRNA 招募到 Cas9 酶上，并稳定 Cas9 酶的活性。在实际应用中，crRNA 和 tracrRNA 通常被设计成一个单一的分子，即 gRNA。

- Cas9 酶（"剪刀"）： Cas9 是一种能够切割 DNA 双链的核酸酶。它本身并不知道要去哪里切割 DNA，它需要 gRNA 来引导。根据目前对 CRISPR--cas 系统的分类，CRISPR 系统已被分为六种不同类型（I--VI），每种类型都利用一组独特的 Cas 蛋白以及 crRNA 来实现 CRISPR 干扰。其中 I 型和 III 型系统利用大型多 Cas 蛋白复合物进行 crRNA 结合和靶序列降解，而 II 型 CRISPR 系统则采用单一的 DNA 核酸内切酶 Cas9 来识别双链 DNA 底物，并通过不同的核酸酶结构域（HNH 或 RuvC）切割每条链。

图 3 不同亚型代表性 Cas9 同源蛋白的结构域组织示意图。

- PAM 序列（"定位标记"）： Cas9 酶在切割 DNA 时，还需要识别 DNA 序列中一个简短的"原型间隔基相邻基序"（Protospacer Adjacent Motif，简称 PAM）。PAM 序列通常是 NGG（N 可以是任何核苷酸）。PAM 序列的存在是 Cas9 酶能够识别并结合到目标 DNA 位点的一个关键先决条件，它确保 Cas9 酶不会错误地切割细菌自身的 CRISPR 区域。

图 4 CRISPR-Cas9 系统示意图

工作流程：

- 结合：人工合成的 gRNA 会与 Cas9 酶结合，形成一个复合物。
- 定位：这个 Cas9-gRNA 复合物会在 DNA 中寻找与 gRNA 的 crRNA 部分完全匹配的序列。
- 识别 PAM：一旦找到匹配的 DNA 序列，Cas9 还需要识别其附近的 PAM 序列。
- 切割：当 gRNA 和 PAM 都被识别后，Cas9 酶就会在目标 DNA 位点执行切割，产生一个 DNA 双链断裂（Double-Strand Break, DSB）。

DNA 的修复机制：

一旦 DNA 发生双链断裂，细胞自身就会启动修复机制：

- 非同源末端连接 (NHEJ)： 这是细胞中最常见的修复方式。它是一种"简单粗暴"的修复方式，容易在断裂处引入小片段的插入或删除（indels），从而导致基因失活（基因敲除）。
- 同源定向修复 (HDR)： 如果在细胞中提供一个与断裂位点同源的 DNA 模板，细胞就可以利用这个模板进行精确修复。科学家可以利用这个机制，在断裂处插入新的 DNA 序列，从而实现基因的精确修改（基因敲入）。

图 5 . Double stranded break (DSB), endogenous DNA repair can occur by (A) non-homologous end joining (NHEJ) resulting in random indels, or by (B) homology-directed repair (HDR) which uses a template DNA strand for precise repair.

CRISPR-Cas9 的重要性和应用：

CRISPR-Cas9 技术之所以如此重要，是因为它具有以下优点：

- 精确性高： 能够非常精确地靶向基因组中的特定位置。
- 操作简便： 相较于之前的基因编辑技术，CRISPR-Cas9 更易于设计和操作。
- 成本较低： 使得基因编辑技术更加普及。
- 高效性： 能够相对高效地实现基因编辑。

这些优势使得 CRISPR-Cas9 在各个领域都展现出巨大的潜力：

- 基础科学研究：用于研究基因功能、构建基因敲除/敲入模型。
- 疾病治疗：
  - 基因疗法：纠正导致遗传性疾病的基因缺陷。
  - 癌症治疗：增强免疫细胞攻击癌细胞的能力，或直接靶向癌细胞中的致病基因。
  - 传染病防治：靶向病毒基因组，阻止病毒复制。
- 农业：
  - 作物改良：培育具有抗病、抗虫、耐旱、高产等优良性状的作物。
  - 畜牧业：培育更健康的动物，提高产量。
- 生物技术：用于合成生物学、开发新的生物材料等。

图 6 Applications of Genome Engineering

在CRISPR-Cas9 实操中，构建cas9 稳转株或者共转染cas9 和sgRNA是非常常见的手段。 cas9 蛋白是否能在靶细胞中表达是基因编辑是否成功的关键之一。因此需要通过WB 等方式来检测cas9 可以说非常有必要的。 斯达特旗下Anti-Cas9 重组兔单抗，可用于CRISPR-Cas9 基因检测，助力CRIPSR QC。

Cas9 Recombinant Mouse mAb (S-R500)（货号：S0B1270）

验证数据：

WB result of Cas9 Recombinant Mouse mAb
Primary antibody: Cas9 Recombinant Mouse mAb at 1/2000 dilution
Lane 1: 293T transfected with empty vector whole cell lysate 5 µg
Lane 2: 293T transfected with Cas9-Myc-His fusion protein whole cell lysate
Secondary antibody: Goat Anti-mouse IgG, (H+L), HRP conjugated at 1/10000 dilution
Predicted MW: 150 kDa
Observed MW: 170 kDa

ICC shows positive staining in Cas9-Myc-His transfected 293T cells (top panel) and negative staining in vector-transfected 293T cells (below panel). Anti- Cas9 antibody was used at 1/500 dilution (Green) and incubated overnight at 4°C. Goat polyclonal Antibody to Mouse IgG - H&L (Alexa Fluor® 488) was used as secondary antibody at 1/1000 dilution. The cells were fixed with 4% PFA and permeabilized with 0.1% PBS-Triton X-100. Nuclei were counterstained with DAPI (Blue). Counterstain with tubulin (Red).

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