摘要

 

葡萄糖变异性已被公认为糖尿病并发症的一个危险因素，然而其确切的有害机制仍知之甚少。鉴于线粒体是心脏的主要能量来源，且心血管疾病仍是糖尿病患者死亡的首要原因，本研究旨在评估葡萄糖波动对HL-1心肌细胞系线粒体功能的影响。HL-1细胞分别暴露于低葡萄糖（LG，2.8 mmol/l）、正常葡萄糖（NG，5.5 mmol/l）、高葡萄糖（HG，25 mmol/l）或间歇性高葡萄糖（IHG，在低浓度和高浓度之间波动）环境中，短时间治疗为12小时期间每2小时更换一次培养基，长期治疗为72小时期间每12小时更换一次培养基。通过测量葡萄糖消耗和乳酸产生来评估无氧糖酵解，使用极谱法和ATP测量评估氧化磷酸化，利用荧光探针分析线粒体超氧阴离子和线粒体膜电位（MMP），并通过oxyblot法测量蛋白质氧化。结果表明，与LG和NG相比，IHG和HG均增加了葡萄糖消耗和乳酸产生，且短期和长期治疗之间无显著差异。72小时后，与LG、NG和HG不同，在存在琥珀酸盐的情况下，IHG处理后未观察到线粒体呼吸有任何增加。与LG和NG治疗相比，IHG以及较小程度的HG促进了线粒体膜电位的时间依赖性下降。与LG和NG相比，HG和IHG在12小时和72小时时也增加了超氧阴离子的产生，且IHG在72小时时的增加量更高。最后，与LG和NG处理相比，HG和IHG在72小时时均刺激了蛋白质氧化。这些发现表明，HL-1细胞暴露于葡萄糖波动会促进时间依赖性线粒体功能障碍，提示这种情况对糖尿病患者产生有害影响，可能导致糖尿病性心肌病。

引言

 

糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，随着其发病率的不断上升和相关并发症的增多，已成为全球性的健康问题。心血管疾病（CVD）是糖尿病患者死亡的主要原因，而糖尿病心肌病作为一种独立于冠状动脉疾病和高血压的心脏功能障碍疾病，是糖尿病患者心血管风险增加的重要因素。

葡萄糖变异性，即血糖水平随时间的变化，已被确定为糖尿病并发症的独立危险因素。然而，葡萄糖变异性对心脏产生有害影响的确切机制尚未完全阐明。线粒体是细胞的“能量工厂”，通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP）。在心脏中，线粒体对于满足心脏收缩和舒张所需的高能量需求起着至关重要的作用。心脏线粒体功能障碍已被证实与多种心脏疾病的发生发展有关，包括糖尿病心肌病。

HL-1心肌细胞系源自心房肿瘤细胞，保留了许多原代心肌细胞的特性，如自发收缩和心脏特异性基因的表达。该细胞系为体外研究心脏细胞生物学提供了有价值的模型。在本研究中，我们旨在探讨葡萄糖波动对HL-1心肌细胞线粒体功能的影响，以深入了解糖尿病心肌病的潜在机制。

 

材料与方法

 

细胞培养与处理

 

HL-1心肌细胞培养于添加了10%胎牛血清、100 μM去甲肾上腺素、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的Claycomb培养基中，在37°C、5% CO₂的潮湿环境中培养。对于葡萄糖处理实验，细胞分别暴露于四种不同的葡萄糖条件：LG（2.8 mmol/l）、NG（5.5 mmol/l）、HG（25 mmol/l）或IHG。在IHG组中，葡萄糖浓度在LG和HG之间每2小时交替一次（短时间治疗，12小时）或每12小时交替一次（长期治疗，72小时）。

无氧糖酵解的测定

 

通过测量葡萄糖消耗和乳酸产生来评估无氧糖酵解。在相应的处理时间结束后，收集培养基，并使用商业试剂盒按照制造商的说明测定葡萄糖和乳酸浓度。

 

氧化磷酸化的评估

 

使用极谱氧电极测量氧消耗率（OCR）来评估氧化磷酸化。将细胞接种于密封室中，在基础条件下和添加电子传递链特异性抑制剂后记录OCR。同时，使用基于荧光素酶的ATP测定试剂盒测量ATP水平。

 

线粒体超氧阴离子和线粒体膜电位的分析

 

使用特异性靶向线粒体的荧光探针MitoSOX Red分析线粒体超氧阴离子水平，该探针与超氧阴离子反应产生红色荧光。使用荧光染料JC-1评估线粒体膜电位，JC-1在高线粒体膜电位的健康线粒体中形成聚集体，发出红色荧光，而在去极化的线粒体中以单体形式存在，发出绿色荧光。

 

蛋白质氧化的测定

 

通过oxyblot法测量蛋白质氧化。对细胞裂解物进行2,4-二硝基苯肼（DNPH）衍生化，将羰基转化为稳定的二硝基苯（DNP）腙。然后通过Western blotting使用抗DNP抗体检测DNP标记的蛋白质。

 

结果

 

葡萄糖处理对无氧糖酵解的影响

 

与LG和NG相比，IHG和HG处理在短时间（12小时）和长时间（72小时）实验中均显著增加了葡萄糖消耗和乳酸产生。然而，在每种葡萄糖条件下，短期和长期治疗之间无显著差异。

 

对氧化磷酸化的影响

 

72小时处理后，在存在琥珀酸盐（电子传递链复合体II的底物）的情况下，与LG、NG和HG组相比，IHG组未观察到线粒体呼吸的增加。这表明IHG处理损害了HL-1心肌细胞的线粒体氧化磷酸化功能。

 

线粒体膜电位的变化

 

与LG和NG处理相比，IHG以及较小程度的HG处理促进了线粒体膜电位的时间依赖性下降。IHG组的线粒体膜电位下降更为明显，表明葡萄糖波动对线粒体膜完整性的影响比持续高血糖更为严重。

 

线粒体超氧阴离子产生的改变

 

与LG和NG处理相比，HG和IHG处理在12小时和72小时时均显著增加了线粒体超氧阴离子产生。IHG组在72小时时的超氧阴离子产生增加更为显著，提示葡萄糖波动导致HL-1心肌细胞氧化应激增加。

 

蛋白质氧化的刺激

 

与LG和NG处理相比，HG和IHG处理在72小时时均刺激了蛋白质氧化。oxyblot分析显示碳基团增加，表明暴露于高葡萄糖和葡萄糖波动的HL-1心肌细胞发生了广泛的蛋白质氧化损伤。

 

讨论

 

本研究结果表明，HL-1心肌细胞暴露于葡萄糖波动，尤其是IHG，会促进时间依赖性线粒体功能障碍。IHG和HG条件下葡萄糖消耗和乳酸产生的增加表明细胞向无氧糖酵解转变，这可能是为了在线粒体功能障碍的情况下满足细胞的能量需求。

IHG组氧化磷酸化的损害表明葡萄糖波动破坏了电子传递链的正常功能，导致ATP产生减少。线粒体膜电位的下降和超氧阴离子产生的增加进一步支持了葡萄糖波动导致HL-1心肌细胞线粒体损伤和氧化应激的观点。

蛋白质氧化作为氧化损伤的标志物，也被HG和IHG处理所刺激，表明葡萄糖波动导致细胞蛋白质发生广泛的氧化损伤。这种氧化损伤可能有助于糖尿病患者心脏功能障碍的发生发展。

总之，本研究提供了证据表明葡萄糖波动，尤其是间歇性高葡萄糖，会促进HL-1心肌细胞的线粒体功能障碍。这些发现提示葡萄糖变异性可能对糖尿病患者产生有害影响，导致糖尿病性心肌病的发生。未来需要进一步研究以阐明其潜在的分子机制，并探索减轻葡萄糖波动对心脏有害影响的治疗策略。