引言

 

结直肠癌（CRC）是全球重大的健康负担，是癌症相关死亡的主要原因之一。CRC的进展通常以获得转移潜能为标志，而转移是导致治疗失败和患者预后不良的主要原因。上皮细胞粘附分子（EpCAM）是一种跨膜糖蛋白，与癌症生物学的多个方面有关，包括增殖、存活和转移。值得注意的是，EpCAM在包括CRC在内的多种癌症类型中经常过表达，且与疾病的晚期阶段和不良预后相关。尽管EpCAM在癌症进展中的作用已有充分记录，但EpCAM信号传导在转移过程中的确切机制，特别是在与其他致癌通路串扰的情境下，仍不完全清楚。

肝细胞生长因子受体（HGFR），又称MET，是另一种在癌症发展和进展中起关键作用的受体酪氨酸激酶（RTK）。HGFR被其配体肝细胞生长因子（HGF）激活后，会触发一系列下游信号事件，促进细胞增殖、存活、迁移和侵袭。HGFR信号传导的异常与包括CRC在内的多种癌症的转移有关，使其成为一个有吸引力的治疗靶点。

在本研究中，我们提出了EpCAM和HGFR信号通路之间可能存在串扰，以控制CRC的转移活性。我们假设EpCAM信号传导可能与HGFR信号传导相互作用，从而增强结肠癌细胞的转移潜能，从而为CRC转移的分子机制提供新的见解，并确定潜在的治疗靶点。

材料与方法

 

细胞系和试剂

 

人CRC细胞系，包括HCT116、SW480和SW620，均购自美国模式培养物集存库（ATCC），并在适当的培养条件下进行培养。重组人EpCAM胞外结构域（EpEX）和HGF蛋白从商业来源购买。抗EpCAM中和抗体（EpAb2-6）和HGFR抑制剂（克唑替尼）用于体外和体内实验。

免疫沉淀（IP）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和荧光共振能量转移（FRET）分析

为了探究EpEX和HGFR之间的潜在相互作用，我们对用重组EpEX或HGF蛋白孵育的CRC细胞裂解液进行了IP实验。通过Western印迹法使用特异性抗体检测EpEX-HGFR复合物的存在。ELISA用于量化EpEX和HGFR之间的结合亲和力。荧光共振能量转移（FRET）分析用于可视化和确认活细胞中EpEX和HGFR之间的直接相互作用。

 

Western印迹法

 

我们采用Western印迹法评估了经EpEX、HGF或两者联合处理的CRC细胞系中EpCAM和HGFR信号通路关键蛋白以及下游效应蛋白的表达水平。

 

功能测定

 

我们使用MTT法、划痕愈合实验和Transwell侵袭实验分别评估了EpEX对CRC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。通过在EpEX或HGF刺激前用EpAb2-6或克唑替尼预处理细胞，进一步研究了EpCAM-HGFR串扰在这些过程中的作用。

 

体内模型

 

为了验证靶向EpCAM和HGFR信号传导在CRC治疗中的潜力，我们通过尾静脉注射CRC细胞在裸鼠中建立了转移性和原位结肠癌模型。小鼠分别接受EpAb2-6、克唑替尼或两者联合治疗，并监测肿瘤生长、转移和生存情况。

 

结果

 

EpEX与HGFR相互作用并诱导下游信号传导

 

我们的IP、ELISA和FRET分析表明，EpEX与CRC细胞中的HGFR存在直接相互作用。EpEX刺激激活了HGFR及其下游信号通路，包括RAS/MAPK和PI3K/AKT通路，如ERK和AKT磷酸化增加所示。

 

EpEX和HGF协同介导HGFR信号传导

 

CRC细胞共处理EpEX和HGF导致HGFR信号传导的协同激活，与单独使用任一配体处理相比，下游效应蛋白的磷酸化增强。这种协同效应表明CRC细胞中EpCAM和HGFR信号通路之间存在潜在的串扰。

 

EpEX增强结肠癌细胞的上皮间质转化和转移潜能

 

功能测定显示，EpEX处理促进了CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。从机制上讲，EpEX激活了ERK和FAK-AKT信号通路，进而增强了上皮间质转化（EMT）程序，如间质标志物（如波形蛋白）的上调和上皮标志物（如E-钙黏蛋白）的下调所示。此外，EpEX处理通过降低GSK3β活性稳定了活性β-catenin和Snail蛋白，从而有助于结肠癌细胞的转移潜能。

 

EpAb2-6与克唑替尼联合治疗抑制肿瘤进展并延长生存期

 

体内实验表明，与单药治疗或对照组相比，EpAb2-6与克唑替尼联合治疗显著抑制了转移性和原位CRC模型中的肿瘤生长和转移。此外，联合治疗延长了荷瘤小鼠的生存期，突显了其在治疗高EpCAM表达的CRC患者中的治疗潜力。

 

讨论

 

我们的研究为CRC转移中EpCAM和HGFR信号通路之间的新型串扰提供了有力证据。我们证明EpEX与HGFR相互作用并协同激活下游信号传导，导致结肠癌细胞上皮间质转化和转移潜能增强。此外，我们发现通过EpAb2-6和克唑替尼联合靶向EpCAM和HGFR信号传导可有效抑制CRC模型中的肿瘤进展并延长生存期。

这些发现对针对CRC的靶向治疗具有重要意义。鉴于EpCAM在CRC中的高表达率及其与不良预后的关联，将EpCAM信号传导靶向与HGFR抑制相结合可能代表了一种改善患者预后的有前景的治疗策略。未来需要进一步研究以阐明EpCAM-HGFR串扰的分子机制，并评估这种联合疗法在CRC患者中的临床疗效。