摘要

在基因工程中，融合表达系统被广泛应用于提高重组蛋白的溶解性、稳定性和纯化效率。谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合系统因其高表达产量、简便的纯化流程以及与抗体生产的兼容性而备受关注。然而，商业化的GST亲和层析柱（如Glutathione Sepharose-4B）存在成本高、使用寿命有限以及可扩展性差等问题，限制了其在大规模蛋白质生产中的应用。为克服这些局限性，本研究旨在开发针对GST标签的单克隆抗体（McAbs），以建立经济高效的抗体亲和纯化和免疫磁珠分离系统。通过pGEX-BL21系统表达高纯度的GST融合蛋白，经亲和层析纯化后用于免疫Balb/c小鼠。通过SP2/0骨髓瘤细胞融合和有限稀释法克隆，获得了分泌抗GST McAbs的杂交瘤细胞系。最终建立了两个稳定的杂交瘤细胞系3E和10G。其中，3E McAb对GST融合蛋白（如AIV-NS1、IBDV-VP2、IBV-NP）表现出广泛的反应性，使其成为大规模纯化和检测应用的潜在候选抗体。

1. 引言

基因融合表达系统通过提高表达效率、增强溶解性和简化纯化流程，彻底改变了重组蛋白的生产方式。GST融合系统通过将GST结构域与目标蛋白融合，具有以下优势：

• 高表达产量：GST可促进蛋白在原核（如大肠杆菌）和真核系统中的溶解性。
• 简便的纯化流程：GST融合蛋白可在温和条件下通过谷胱甘肽亲和层析柱进行纯化。
• 抗体兼容性：GST特异性抗体可用于Western blotting、ELISA和蛋白质相互作用研究。

尽管具有上述优势，商业化的GST亲和层析柱仍存在成本高、重复使用性差以及不适合工业规模生产的问题。为解决这些不足，本研究旨在开发针对GST标签的单克隆抗体，以构建抗体亲和基质（如偶联Sepharose的McAbs）和免疫磁珠。此类系统将降低生产成本、提高可扩展性，并在生物技术和诊断领域具有更广泛的应用前景。

2. 材料与方法

2.1 GST融合蛋白的表达与纯化

将pGEX-4T-1载体（GE Healthcare）转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。用0.5 mM IPTG在25°C下诱导蛋白表达16小时。通过超声裂解细胞，并将上清液加载至Glutathione Sepharose-4B柱（GE Healthcare）上。用含10 mM还原型谷胱甘肽的50 mM Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液洗脱GST融合蛋白。通过SDS-PAGE确认蛋白纯度（>95%）。

2.2 单克隆抗体的开发

将50 μg纯化的GST蛋白与弗氏完全佐剂（FCA）乳化后，通过皮下注射免疫Balb/c小鼠。每隔两周用弗氏不完全佐剂（FIA）加强免疫。取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞通过聚乙二醇（PEG 1500）融合。通过间接ELISA筛选杂交瘤细胞，利用固定化的GST蛋白检测阳性克隆。通过有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆，最终获得两个稳定的杂交瘤细胞系（3E和10G），它们均分泌抗GST McAbs。

2.3 抗体表征

• 效价测定：通过间接ELISA评估抗体对GST和GST融合蛋白（AIV-NS1、IBDV-VP2、IBV-NP）的反应性。
• 亚类鉴定：使用小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒（SouthernBiotech）确定抗体亚类。
• 染色体计数：用秋水仙碱将杂交瘤细胞阻滞在中期，并在显微镜下分析染色体分布。
• 亲和力测定：通过竞争性ELISA评估3E和10G McAbs对GST和IBDV-VP2的相对亲和力。

2.4 抗体纯化与应用

通过辛酸-硫酸铵沉淀法从杂交瘤细胞培养上清液中纯化McAbs。通过Western blot和间接ELISA检测纯化抗体对GST和GST融合蛋白的反应性。

3. 结果

3.1 抗GST单克隆抗体的生成

经过三轮亚克隆，建立了两个杂交瘤细胞系3E和10G。这两个细胞系均分泌稳定的IgG1抗体，并表现出良好的生长特性。

3.2 抗体效价与特异性

• 效价：3E McAb对GST的ELISA效价>1×10^{6，对GST融合蛋白（AIV-NS1、IBDV-VP2、IBV-NP）的效价>2×10}5。10G McAb对这些融合蛋白的反应性极低。
• 染色体计数：两个杂交瘤细胞系的染色体数目均在80至94条之间，与预期的融合骨髓瘤-脾细胞核型一致。

3.3 与GST融合蛋白的反应性

3E McAb对GST融合蛋白（AIV-NS1、IBDV-VP2、IBV-NP）表现出强反应性，ELISA效价>2×10^5。相比之下，10G McAb的交叉反应性极低，表明其具有表位特异性结合能力。

3.4 亲和力与纯化效率

纯化的3E McAb对GST（1.28×10^{5）和IBDV-VP2（6.4×10}4）的亲和力相当，表明其在蛋白质纯化中具有广泛的应用潜力。

4. 讨论

GST融合系统是重组蛋白研究的重要工具，但商业化亲和层析柱限制了其在大规模应用中的使用。本研究成功开发了两种抗GST McAbs，其中3E克隆对GST融合蛋白表现出更优的反应性。3E McAb的主要优势包括：

• 高特异性：与内源性蛋白的交叉反应性低，减少了假阳性结果。
• 广泛适用性：适用于检测多种GST融合蛋白（如病毒抗原、酶）。
• 成本效益：可开发可重复使用的抗体亲和基质，降低纯化成本。

未来的研究将聚焦于：

• 亲和力成熟：工程化改造3E McAb的高亲和力变体，以提高纯化效率。
• 免疫磁珠开发：将3E McAbs偶联至磁珠，实现快速、可扩展的蛋白质捕获。
• 单细胞分析：将GST融合蛋白与流式细胞术或质谱流式细胞术结合，用于高通量筛选。

5. 结论

本研究证明了开发抗GST单克隆抗体用于大规模蛋白质纯化的可行性。3E McAb因其高效价、广泛反应性和一致的亲和力，为商业化GST亲和层析柱提供了稳健的替代方案。通过建立抗体纯化系统，本研究推动了重组蛋白生产的可扩展性和成本效益，对生物制药、诊断和合成生物学领域具有重要影响。

本文系统地阐述了抗GST单克隆抗体的开发过程，为解决现有GST融合纯化方法的局限性提供了可行的解决方案。研究结果凸显了抗体系统在推动蛋白质工程技术发展中的潜力。