摘要

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于前列腺癌。约90%的膀胱癌为尿路上皮癌，其中约80%的初诊膀胱癌为非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC），包括非肌层浸润性乳头状癌（pTa）、原位癌（pTis）和仅侵犯黏膜固有层的肿瘤（pT1）。NMIBC的一个重大问题是其可能进展为肌层浸润性膀胱癌（MIBC），导致肿瘤侵袭、转移，最终影响患者的生存率和生活质量。既往研究表明，化疗后易进展为MIBC的复发膀胱癌细胞更可能呈现间质表型。此外，研究发现经膀胱内化疗的复发膀胱癌细胞可分泌生长调节致癌基因-α（GRO-α），且GRO-α-CXCR2通路的激活可促进膀胱癌细胞的上皮-间质转化（EMT）过程。基于这些发现，本研究旨在进一步阐明化疗药物诱导膀胱癌细胞产生GRO-α的分子机制，以及GRO-α-CXCR2通路如何调控EMT，以期确定有效的治疗策略，预防膀胱癌化疗后的复发和进展。

1. 引言

膀胱癌在全球范围内造成了沉重的健康负担。从NMIBC进展为MIBC是疾病发展的关键事件，会显著恶化预后。EMT是一种基本的生物学过程，上皮细胞在此过程中获得间质细胞特征，增强其运动性和侵袭性。了解膀胱癌中EMT的分子驱动因素，尤其是在化疗诱导复发的情况下，对于开发靶向治疗至关重要。GRO-α-CXCR2轴已成为这一过程中潜在的关键调控因子，本研究深入探讨了其复杂机制。

2. 方法

2.1 细胞培养与表型分析

从配对的原发性和化疗复发膀胱癌组织中获取膀胱癌细胞，采用标准细胞培养技术进行培养，并进行形态学检查。利用免疫荧光染色和流式细胞术评估上皮和间质标志物，如E-钙黏蛋白和波形蛋白，以及干细胞标志物如CD44和67LR。

2.2 蛋白质组学分析

采用无标记蛋白质组学结合质谱技术，鉴定配对的原发性和化疗复发膀胱癌细胞培养上清液中的差异表达蛋白。

2.3 功能实验

进行ELISA、Western blot和启动子活性实验，研究化疗药物诱导GRO-α表达的分子机制以及GRO-α对Snail的调控。还采用了小干扰RNA（siRNA）、定点诱变和EMT相关基因启动子活性检测等方法。

2.4 体内研究

建立裸鼠动物模型，并构建四环素诱导的（Tet-on）GRO-α shRNA表达载体，研究体内干扰GRO-α-CXCR2通路对膀胱癌细胞EMT的影响。

3. 结果

3.1 化疗复发膀胱癌细胞的表型变化

原发膀胱癌细胞通常呈现上皮形态，以紧密的细胞聚集为特征。相比之下，化疗复发膀胱癌细胞呈现间质表型，细胞扁平，运动性增加，细胞骨架重排。这些变化伴随着E-钙黏蛋白的下调和波形蛋白的上调。此外，化疗复发细胞的迁移和侵袭率是原发细胞的5.7–8.2倍。原发细胞和复发细胞均可形成肿瘤球，复发细胞的成球能力比原发细胞高2.1–5.8倍。流式细胞术显示，化疗复发样本中CD44和67LR阳性细胞的比例高于原发肿瘤。

3.2 共培养实验与GRO-α分泌

当原发膀胱癌细胞与化疗复发细胞共培养时，原发细胞获得成纤维细胞样形态，失去紧密连接，发生细胞骨架重排，同时波形蛋白上调，E-钙黏蛋白下调。蛋白质组学分析鉴定出GRO-α为差异表达最显著的蛋白，在复发细胞中增加了4.15倍。ELISA证实化疗复发细胞中GRO-α的分泌增加。用GRO-α处理原发细胞可诱导其发生间质形态转化，而用GRO-α-CXCR2通路抑制剂SB-656933处理可阻止这一转化。在化疗复发细胞中，SB-656933不仅使其形态向上皮样转变，还逆转了其间质表型。Western blot显示，GRO-α处理降低了原发细胞中E-钙黏蛋白的表达，增加了波形蛋白的表达，而联合使用SB-656933和GRO-α则消除了这些效应。用SB-656933阻断GRO-α-CXCR2通路可上调化疗复发细胞中E-钙黏蛋白的表达，下调波形蛋白的表达。

3.3 化疗药物诱导GRO-α表达的分子机制

ELISA显示，表柔比星处理显著增加了原发膀胱癌细胞中GRO-α的分泌。细胞周期同步化显示，表柔比星在G1/S期诱导GRO-α表达，而凋亡细胞处于G2/M期。用GRO-α基因启动子的缺失突变体进行荧光素酶报告实验表明，NF-κB参与调控GRO-α的表达。将NF-κB（p65S276D）转染到原发细胞中可增强GRO-α启动子活性。Western blot显示，药物处理3小时后IκB发生磷酸化，早于GRO-α的表达。IκBα过表达或NF-κB siRNA可抑制表柔比星诱导的GRO-α表达。此外，表柔比星在G1/S期激活p38，而p38抑制剂SB202190或SB203580可降低IκB的磷酸化，进而减少GRO-α的表达。

3.4 GRO-α对Snail的调控

Western blot显示，GRO-α诱导原发膀胱癌细胞中Snail的表达，而预先用SB-656933处理可阻断这一效应。荧光素酶报告实验显示，GRO-α抑制E-钙黏蛋白启动子活性，并增强Snail抑制E-钙黏蛋白启动子活性的能力。GRO-α还促进了Snail对其下游靶基因occludin和芳香酶转录的抑制。用显性负性CXCR2突变体阻断GRO-α-CXCR2通路可减弱Snail对occludin和芳香酶启动子活性的抑制。敲低GRO-α表达导致化疗复发细胞中核Snail几乎完全消失，而GRO-α以剂量依赖的方式促进原发细胞中Snail从细胞质向细胞核的转位。GRO-α还诱导Snail磷酸化，而这一效应可被PI3K通路抑制剂抑制。共转染HA-Snail和PI3KCA后进行32P标记实验证实，HA-Snail可被PI3KCA磷酸化。定点诱变鉴定出Ser246为GRO-α诱导的PI3K介导的Snail磷酸化位点。将Ser246突变为丙氨酸（Snail Ser246Ala）显著降低了GRO-α介导的E-钙黏蛋白、occludin和芳香酶启动子的转录抑制。

3.5 体内干扰GRO-α-CXCR2通路的效果

将Tet-on GRO-α shRNA表达载体转染到原发膀胱癌细胞中，并建立NOG小鼠异种移植模型。体内荧光成像显示，表柔比星组肿瘤体积最初减小，但6周后开始增加。相比之下，表柔比星+Tet组在12周内肿瘤体积持续减小（>82%）。免疫组织化学显示，12周内表柔比星组每视野中波形蛋白阳性肿瘤细胞呈增加趋势，而表柔比星+Tet组呈减少趋势。免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜证实，表柔比星+Tet组波形蛋白表达较弱，而表柔比星组肿瘤边缘波形蛋白表达较强。

4. 结论

4.1 化疗复发膀胱癌中EMT增强

化疗复发膀胱癌细胞更易发生EMT，其形态和表型特征均表现为间质表型。

4.2 自分泌GRO-α-CXCR2通路在EMT诱导中的作用

化疗复发膀胱癌细胞通过自分泌GRO-α-CXCR2通路诱导EMT，凸显了该轴在促进间质转化中的关键作用。

4.3 p38/MAPK-NF-κB通路在GRO-α表达中的作用

化疗药物通过p38/MAPK-NF-κB通路诱导膀胱癌细胞中GRO-α的表达，为调控GRO-α产生的上游信号事件提供了见解。

4.4 PI3K介导的Snail磷酸化在转录调控中的作用

GRO-α通过影响PI3K介导的Snail磷酸化增加核Snail的积累并调控其转录活性，从而调控EMT相关基因的表达。

4.5 体内阻断EMT和复发

体内干扰GRO-α-CXCR2通路可有效阻断膀胱癌细胞中EMT和该通路介导的复发促进效应，表明其作为治疗靶点的潜力。

总之，本研究全面了解了GRO-α-CXCR2通路介导的化疗诱导复发膀胱癌中EMT的分子机制。这些发现为开发预防膀胱癌化疗后复发和进展的新型治疗策略提供了有价值的见解，GRO-α-CXCR2轴成为一个有前景的干预靶点。