摘要：凝血酶诱导的血管生成机制长期以来未被充分阐明。本研究通过基因芯片阵列技术，深入探究凝血酶刺激细胞的恶性表型，发现凝血酶可显著上调 GRO-α 的表达。进一步的研究证实，GRO-α 作为一种 CXC 趋化因子致癌基因，在凝血酶诱导的血管生成过程中发挥着至关重要的作用。本文详细阐述了凝血酶通过上调 GRO-α 促进血管生成的相关机制，包括对多种肿瘤细胞系和内皮细胞的影响，以及在体内外实验中的表现，为深入理解凝血酶诱导血管生成的机制提供了新的视角。

一、引言

血管生成在肿瘤的生长、进展和转移过程中起着关键作用。凝血酶作为一种丝氨酸蛋白酶，不仅在血液凝固过程中发挥核心作用，还参与多种生理和病理过程，包括血管生成。然而，凝血酶诱导血管生成的具体机制尚未完全明确。了解这一机制对于开发针对肿瘤血管生成的靶向治疗策略具有重要意义。

二、凝血酶上调 GRO-α 的发现

本研究首先利用基因芯片阵列技术，研究凝血酶刺激细胞的恶性表型。在未分化小鼠细胞系（UMCL）中，观察到凝血酶（0.5 - 1 u/ml/24 小时）可使 GRO-α 的表达上调 168 倍。为进一步验证这一结果，在多种肿瘤细胞系（包括鼠 B16F10 黑色素瘤和 4T1 乳腺癌、人 DU145 和 PC3 前列腺癌、人 MCF7 乳腺癌）以及人脐静脉（HUVEC）和脑微血管内皮细胞中，通过 mRNA 和蛋白质分析，均观察到凝血酶诱导的 GRO-α 上调。特别是在 PC3 和 MCF7 细胞中，凝血酶在 24 小时后将 GRO-α 的分泌增加了 25 - 64 倍。

三、GRO-α 的生物学特性及其与血管生成的关系

GRO-α 是一种 CXC 趋化因子致癌基因，它能够与七跨膜受体 CXCR2 结合，从而增强多种肿瘤细胞系的生长、趋化性和转移。研究表明，GRO-α 诱导的转移与血管生成增加密切相关。在肿瘤微环境中，血管生成是肿瘤获取营养和氧气、排出代谢废物的重要途径，而 GRO-α 可能通过促进血管生成来支持肿瘤的生长和转移。

四、抗 GRO-α Ab 对凝血酶诱导血管生成的影响

为了深入探究 GRO-α 在凝血酶诱导血管生成中的作用，研究者在 72 小时的鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）测定中，检查了抗 GRO-α Ab 对凝血酶诱导血管生成的影响。结果显示，GRO-α（5ug/鸡蛋/天）使血管生成增强了 2.2 倍（n = 19，p = 0.005），这为 GRO-α 作为血管生成生长因子提供了直接证据。同时，凝血酶也将血管生成增强了 2.7 倍（n = 9，p = 0.01）。然而，抗 GRO-α Ab 能够将凝血酶诱导的血管生成抑制到基础对照水平，而 IgG 对照 Ab 则没有影响（n = 9）。此外，在基质胶中的内皮（HUVEC）脐带形成试验中也获得了类似的结果，进一步证实了 GRO-α 在凝血酶诱导血管生成中的关键作用。

五、凝血酶对血管生成相关蛋白的上调作用

凝血酶不仅上调 GRO-α 的表达，还对多种血管生成相关蛋白产生影响。研究发现，凝血酶诱导的脐带形成增加 1.5 倍（n = 20，p < 0.05），同时上调了 KDR、Ang-2、MMP-1、MMP-2、CXCR2 和 CD31（血管生成标志物）蛋白的表达，与对照细胞（n = 3）相比有显著差异。在肿瘤细胞（PC3、B16F10 和 4T1 细胞）（n = 3）中也观察到了类似的 GRO-α 上调现象。并且，所有凝血酶/TRAP 基因上调都被抗 GRO-α Ab 完全抑制，而不受无关的 Ab 处理细胞的影响（n = 3），这表明 GRO-α 在凝血酶诱导的血管生成相关蛋白上调过程中起着核心作用。

六、GRO-α 上调的特异性及与其他血管生长因子的关系

为了验证 GRO-α 上调的特异性，研究者探讨了 bFGF 和 VEGF 对 GRO-α 表达的影响。免疫印迹结果显示，bFGF 和 VEGF 对 GRO-α 的上调没有影响，但它们能够上调其他血管生长因子，这进一步证明了对凝血酶诱导 GRO-α 上调的特异性。

七、siRNA GRO-α 敲低实验的结果

在 siRNA GRO-α 敲低（KD）HUVEC 以及 4T1 和 B16F10 细胞中，研究者注意到对血管生长因子凝血酶上调的类似抑制。这表明通过敲低 GRO-α 的表达，可以有效阻断凝血酶对血管生长因子的上调作用，进一步强调了 GRO-α 在凝血酶诱导血管生成过程中的不可或缺性。

八、体内肿瘤生长研究的结果

注射皮下 GRO-α KD 4T1 细胞的野生型小鼠体内肿瘤生长研究显示，肿瘤生长受损 2 - 4 倍，且不受内源性凝血酶（水蛭素处理）影响的自发转移和血管生成也受到抑制。这一结果在体内水平证实了凝血酶诱导的血管生成需要 GRO-α 的上调，肿瘤细胞和内皮细胞中 GRO-α 的凝血酶上调有助于肿瘤血管生成。

九、结论

本研究通过一系列体内外实验，深入揭示了凝血酶诱导血管生成的机制，即凝血酶通过上调 GRO-α 的表达，进而促进血管生成相关蛋白的上调，最终支持肿瘤的生长和转移。GRO-α 在这一过程中发挥着核心作用，其作为血管生成生长因子的特性得到了充分证实。这些发现为针对肿瘤血管生成的靶向治疗提供了新的理论依据和潜在靶点，未来有望通过开发针对 GRO-α 或其信号通路的药物，来抑制肿瘤的血管生成，从而达到治疗肿瘤的目的。然而，仍需要进一步的研究来深入探索 GRO-α 信号通路的具体机制，以及如何更有效地将其应用于临床治疗。