在重组蛋白表达和纯化过程中，为了便于纯化和检测，通常会在目的蛋白上添加亲和标签（affinity tag）。其中，FLAG (DYKDDDDK, DDDDK等)标签是常用的，因为这些标签的表达载体是广泛可用的。

一、Flag 融合标签的独特结构

Flag 融合标签由八个氨基酸（DYKDDDDK）组成，看似简单却蕴含着精妙的设计。其结构短小精悍，这一特点为后续的编码和操作带来极大便利。在这个八肽序列中，芳香族氨基酸发挥着关键作用，它们是抗原 - 抗体相互作用的主要参与者。序列中的第二个氨基酸 Tyr 尤为重要，其左侧与带负电的 Asp 相连，这种组合增强了 Tyr 的抗原性。而 Tyr 下游的六个氨基酸（Lys - Asp - Asp - Asp - Asp - Lys）形成了高度亲水的序列，该序列能够塑造出高度暴露的三维蛋白质构型，从而展现出强大的抗原性。正是这种独特的结构，使得 Flag 短肽能够高效地发挥蛋白质标签的功能。

二、Flag 融合标签的显著优势

1.编码简易

仅由八个氨基酸构成的 Flag 序列，编码时只需一条人工合成的寡核苷酸链即可完成。相比其他复杂的标签，这种简易的编码方式大大降低了实验成本和操作难度，提高了实验效率，为科研人员节省了大量的时间和精力。

2.切割位点灵活

Flag 标签含有肠激酶切割位点，肠激酶能够精准识别短肽 C 端的五个氨基酸（DDDDK）。通过肠激酶处理，科研人员可以轻松除去标签，获得天然的非融合蛋白质，这对于需要研究蛋白质天然结构和功能的实验至关重要，确保了实验结果的准确性和可靠性。

3.融合位置多样

Flag 抗原标签的融合位置十分灵活，可以被融合到目的蛋白质的 N 端或 C 端。研究表明，融合在 N 端的 FLAG 序列稳定性良好，在大肠杆菌等表达系统中不会被蛋白酶轻易除去，并且在酵母和大肠杆菌中的表达性质相似。此外，当目的蛋白 N 端融合了 Flag 多肽后，C 末端还能继续融合其他模块或不同的亲和配体，为蛋白质的多功能研究和应用提供了广阔空间。

三、精准去除 Flag 标签的方法

在蛋白研究过程中，有时需要去除 Flag 标签以获得纯净的目标蛋白。目前常用的标签切除方法主要包括两类：一是利用特异性蛋白酶进行酶切；二是在融合蛋白中引入蛋白内含肽系统。其中，蛋白酶切除法是应用最广泛的方法，常用的蛋白酶包括：肠激酶（enterokinase）、凝血酶、Xa因子、烟草蚀纹病毒蛋白酶（TEV）、genenaseⅠ和3C蛋白酶等，这些蛋白酶都能在融合标签与目的蛋白之间特定位点进行切割。

1. 肠激酶切除法：

肠激酶是去除N端Flag标签最常用的蛋白酶，能精确识别D-D-D-D-K五肽序列。其切割效率主要取决于赖氨酸（K）后的第一个氨基酸残基。Flag标签（DYKDDDDK）本身就含有肠激酶识别位点，酶切后可获得仅保留4个氨基酸残基的短肽标签。研究人员已成功克隆表达牛肠激酶催化亚基，该酶具有活性高、pH适应范围广等优点，且能在多种变性剂和去污剂条件下保持切割活性，切割产物不含多余氨基酸残基。

Hosfield等采用不依赖连接的克隆技术（LIC），在Flag标签与目的蛋白之间引入特定氨基酸残基（X），构建了-DYKDDDDK-X-R序列（R代表目的蛋白）。以钙调蛋白基因为模型，系统研究了X残基对酶切效率的影响。实验结果显示：当X为Lys、Ala、Leu、Ile、Phe、Glu、Met、Asp或Asn时，切割效率可达80%以上；而当X为Tyr或Pro时，由于空间位阻效应，切割效率会降至70%以下。这一发现对获得天然蛋白具有重要意义。因此，我们可以采用LIC技术将Flag标签直接连接目的基因，表达纯化后通过肠激酶切除标签，从而获得具有天然结构和功能的蛋白质。

2. 凝血酶切割

凝血酶也是一种应用广泛的蛋白酶，不过它在切割重组蛋白后，会在切割位点的 C 端保留两个氨基酸残基。凝血酶可以识别两种类型的氨基酸序列，对 X4 - X3 - P - P [K] - X1΄ - X2΄ 这种序列的识别效果更佳。在一些对蛋白质 C 端氨基酸序列要求不那么严格的实验中，凝血酶可作为去除 Flag 标签的选择之一。

3. Xa 因子切割

Xa 因子是一种高效的去除融合标签的工具酶，它能够特异性识别 I - E [D] - G - R - X1 序列，并从融合标签的 C 末端进行切除。在特定的实验条件和蛋白质结构下，Xa 因子能够发挥其高效切割的优势，为科研人员提供了另一种去除 Flag 标签的有效途径。

Flag 融合标签凭借其独特的结构、显著的优势、多样的抗体种类以及灵活的标签去除方法，在蛋白纯化与研究领域占据着重要地位。